胡 堯 張麗麗 侯永清 丁斌鷹 朱惠玲 劉玉蘭 楊震國 張 偉

（武漢工業(yè)學(xué)院,動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430023）

在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中,細(xì)菌、病毒、飼養(yǎng)管理以及環(huán)境因素等各方面的刺激,都會(huì)使仔豬處于應(yīng)激狀態(tài),嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生高燒、腹瀉、采食量下降等癥狀[1],造成仔豬生長受阻,生產(chǎn)性能下降。目前對(duì)仔豬應(yīng)激的防治措施很多,其中營養(yǎng)調(diào)控是一條行之有效的解決途徑。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）具有較強(qiáng)抗氧化和抗炎作用[2]。在小鼠和大鼠上的試驗(yàn)研究已經(jīng)表明,NAC對(duì)大腸桿菌脂多糖（LPS）應(yīng)激誘發(fā)的肝臟損傷有很好的保護(hù)作用[3]?？梢奛AC可在仔豬應(yīng)激中發(fā)揮相應(yīng)作用。當(dāng)前對(duì)NAC的研究多以小鼠和大鼠為模型,在仔豬應(yīng)激中的作用還未見報(bào)道。本試驗(yàn)擬用LPS多次刺激斷奶仔豬建立免疫應(yīng)激模型,觀測(cè)NAC對(duì)LPS應(yīng)激仔豬生長性能和血漿生化指標(biāo)的影響,探討NAC是否具有緩解脂多糖應(yīng)激、改善仔豬抗氧化能力的作用,為緩解仔豬免疫應(yīng)激提供新的方法及途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

N-乙酰半胱氨酸（NAC）:純度≥98%,由武漢武大弘元藥業(yè)提供。LPS:大腸桿菌血清型O55∶B5,由Sigma公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取來源一致,平均體重為（11.58±0.26）kg的（35±2）日齡仔豬（杜洛克×長白×大白）24頭,隨機(jī)分為2組,每組設(shè)6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)2頭仔豬。試驗(yàn)為單因素設(shè)計(jì),分2個(gè)階段,共20 d。試驗(yàn)前9天,未進(jìn)行LPS應(yīng)激處理,對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加500mg/kg NAC的飼糧。試驗(yàn)后11 d,分別將2個(gè)組同一重復(fù)中的1頭仔豬分出單獨(dú)飼養(yǎng),分別于試驗(yàn)的第10天、第13天和第20天,按100 mg/kg的劑量腹膜下注射LPS,另一頭仔豬注射同樣體積的滅菌生理鹽水。各組的基礎(chǔ)飼糧及營養(yǎng)水平一致。于試驗(yàn)第10天和第20天空腹稱重,前腔靜脈采血,分離血漿,測(cè)定部分血漿生化指標(biāo)。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬預(yù)試3 d后進(jìn)行正式試驗(yàn)。豬舍為全封閉式,屋頂以排氣扇通風(fēng),試驗(yàn)期間豬舍保持溫度為22～25℃。試驗(yàn)豬在代謝籠中單獨(dú)飼養(yǎng),自由采食,鴨嘴式飲水器飲水,定時(shí)清掃和消毒豬舍。

1.4 飼糧組成

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要配制,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet （air-dry basis,%）

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長性能

詳細(xì)記錄每天的采食量,分別于試驗(yàn)的第1天、第10天和第20天清晨空腹稱重（禁食12 h,禁水1 h后）,計(jì)算試驗(yàn)豬在第1～9天以及第10～20天的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）。

1.5.2 血漿生化指標(biāo)的測(cè)定

分別于試驗(yàn)第10天和第20天注射LPS或生理鹽水3 h后前腔靜脈無菌采血,用10m L肝素抗凝管收集,靜置15 m in后以3 000 r/m in離心10 m in,取上清液。采用放射免疫分析法（RIA）測(cè)定血漿中表皮生長因子（EGF）、胰島素（INS）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）,試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。用日立7020全自動(dòng)生化分析儀酶偶聯(lián)速率法測(cè)定血漿尿素氮（BUN）;丙二醛（MDA）的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法,試劑盒購自南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶比色法;還原型谷胱甘肽（GSH）的測(cè)定采用還原型谷胱甘肽二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）定量測(cè)定法,試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)第1～9天的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（independent-samp le t test）進(jìn)行分析。試驗(yàn)第10～20天的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0一般線性模型（GLM）下的多因素方差分析,對(duì)交互作用顯著的指標(biāo),進(jìn)一步分LPS應(yīng)激組和非應(yīng)激組,對(duì)組內(nèi)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。以P＜0.05和P＜0.01為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加NAC對(duì)仔豬生長性能的影響

由表2可知,試驗(yàn)第1～9天,未注射LPS, NAC組與對(duì)照組相比,在ADG、ADFI及F/G方面均沒有顯著差異（P＞0.05）。

由表3可知,在試驗(yàn)的第10～20天,LPS多次刺激顯著降低仔豬ADFI、末重、ADG和F/G;添加NAC對(duì)仔豬ADFI和料重比沒有顯著影響（P＞0.05）;添加NAC和LPS刺激對(duì)ADG的影響存在交互作用（P＜0.05）,在LPS應(yīng)激組,NAC組ADG顯著高于無NAC組（P＜0.05）,這說明NAC可以顯著緩解LPS應(yīng)激對(duì)仔豬生長的抑制。

表2 飼糧添加NAC對(duì)LPS應(yīng)激前仔豬生長性能的影響Table 2 E ffects of N-acetylcysteine supp lementation on grow th perform ance o f pig lets be fore LPS challenge（1～9 d） （n=12）

表3 飼糧添加NAC對(duì)LPS刺激仔豬生長性能的影響Table 3 Ef fec ts of N-acetylcysteine supp lem entation on grow th performance of piglets after LPS challenge（10～20 d） （n=6）

2.2 飼糧添加乙酰半胱氨酸對(duì)仔豬血漿生化指標(biāo)的影響

2.2.1 LPS首次刺激

由表4可知,比較第10天的血漿生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn),LPS刺激顯著降低血漿EGF水平（P＜0.05）,顯著提高BUN水平（P＜0.05）,對(duì)其他血漿指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）;NAC可顯著提高血漿EGF和SOD水平（P＜0.05）,對(duì)其他血漿指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）;添加NAC與LPS刺激對(duì)血漿EGF水平的影響存在互作效應(yīng)（P＜0.05）。在應(yīng)激處理中,NAC組比空白組血漿EGF水平增加28.4% （P＜0.05）;應(yīng)激處理中添加NAC使BUN降低18.1%（P＜0.05）。在LPS刺激下NAC有提高血漿SOD水平的趨勢(shì)（P＞0.05）;添加NAC與LPS刺激對(duì)血漿GSH水平的影響存在互作效應(yīng)（P＜0.05）,NAC可顯著提高LPS刺激下仔豬血漿GSH水平（P＜0.05）。

2.2.2 LPS多次刺激

從第20天的血漿生化指標(biāo)結(jié)果可以看出（表4）,LPS刺激顯著降低血漿EGF水平（P＜0.05）,顯著提高BUN水平（P＜0.05）,對(duì)其他血漿指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）;添加NAC可極顯著提高血漿EGF和GSH水平（P＜0.01）,有降低MDA水平的趨勢(shì)（P=0.06）,對(duì)其他血漿指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）;在應(yīng)激組中,NAC組比空白組血漿EGF水平增加64.6%（P＜0.05）。

3 討 論

試驗(yàn)第1～9天的結(jié)果表明,在本試驗(yàn)條件下,飼糧添加NAC對(duì)仔豬的生長性能無顯著影響。試驗(yàn)的第10～20天,LPS刺激處理下添加NAC對(duì)ADG有顯著影響（P＜0.05）,非LPS應(yīng)激處理添加NAC對(duì)ADG沒有影響,這說明NAC可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的生長抑制。

LPS能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生急性細(xì)菌感染癥狀,如厭食、嗜睡和發(fā)熱等癥狀,導(dǎo)致動(dòng)物的采食量下降、精神不振,營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)重分配,從而最終導(dǎo)致生產(chǎn)性能降低。本試驗(yàn)中,LPS刺激導(dǎo)致仔豬的日增重和日采食量顯著降低,這與劉堅(jiān)等[4]的研究結(jié)果一致。飼糧中添加NAC可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的生長抑制,其可能的機(jī)理如下。1）NAC促進(jìn)EGF的生成。EGF是一種由53個(gè)氨基酸構(gòu)成的活性多肽,它的分泌受到激素的影響,生長抑素可以抑制其釋放[5]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示添加NAC可顯著提高血漿EGF水平,這說明NAC促進(jìn)了EGF的生成,相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。EGF主要生理活性是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分裂分化,促進(jìn)其生長[6]。有研究表明EGF有促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育、修復(fù)炎癥性腸炎導(dǎo)致的仔豬受損腸道的作用[7]。范志勇等[8]的研究指出,通過注射適當(dāng)劑量的EGF可以顯著提高早期斷奶仔豬的生長性能。本試驗(yàn)結(jié)果表明NAC可能通過促進(jìn)EGF分泌、修復(fù)LPS刺激導(dǎo)致腸黏膜損傷,改善養(yǎng)分的吸收,進(jìn)而緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的生長抑制。2）改善機(jī)體抗氧化能力。在機(jī)體中,氧化劑和抗氧化劑之間的平衡是嚴(yán)格調(diào)節(jié)的,因?yàn)檫@種平衡對(duì)維持生物大分子和細(xì)胞的功能十分重要。當(dāng)氧化劑的增加超過了抗氧化劑的清除能力時(shí)就被定義為氧化應(yīng)激,導(dǎo)致氧化損傷,外在表現(xiàn)為動(dòng)物的生長發(fā)育受阻、生長性能顯著下降。有研究表明,通過不同途徑改善機(jī)體的抗氧化能力,可以提高動(dòng)物的生長性能[9-10]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種重要分解產(chǎn)物,常被用以作為脂質(zhì)過氧化程度的檢測(cè)指標(biāo)。本試驗(yàn)對(duì)仔豬MDA水平檢測(cè)結(jié)果說明NAC一定程度上有抗氧化損傷的作用。GSH和SOD在清除自由基、抗氧化損傷和維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面都起著重要作用[11],其水平及活力間接反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力[12]。本次試驗(yàn)對(duì)仔豬血液中抗氧化指標(biāo)的觀測(cè)結(jié)果說明,飼糧添加NAC可增強(qiáng)仔豬機(jī)體抗氧化能力,進(jìn)而緩解了LPS刺激導(dǎo)致的生長抑制。

表4 飼糧添加NAC對(duì)LPS刺激仔豬血漿生化指標(biāo)的影響Table 4 Ef fects of N-acetylcysteine supplementation on plasm a biochem ical indices of piglets after LPS challenge （n=6）

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下,仔豬飼糧中添加500 mg/kg NAC,對(duì)健康仔豬生長性能無顯著影響,可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的生長抑制,這與NAC可促進(jìn)EGF生成和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

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（編輯 陳圓）