曹滿湖 方熱軍 陳 娟

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128）

磷（phosphate,Pi）是動(dòng)物體內(nèi)除鈣以外含量最豐富的礦物質(zhì),對(duì)動(dòng)物體內(nèi)骨骼組織的形成與維持滲透壓和酸堿平衡的相對(duì)穩(wěn)定、能量利用、蛋白質(zhì)合成、生長(zhǎng)和細(xì)胞分化等各種代謝過(guò)程起著重要作用[1-2]。但磷的大量使用和低利用率導(dǎo)致了兩大問(wèn)題:一是磷資源的浪費(fèi);二是嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境破壞與污染[3]。因此,如何提高磷的吸收始終是磷研究的一個(gè)熱點(diǎn)和難題。無(wú)機(jī)磷的吸收主要與Na+/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白有關(guān),在小腸中參與磷吸收的載體蛋白主要為Ⅱb型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4]。低磷狀況下小腸Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白m RNA表達(dá)量和磷的吸收關(guān)系如何,其在小腸各部位中的表達(dá)是否存在差異,國(guó)內(nèi)尚少見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過(guò)研究添加不同磷水平的飼糧對(duì)大鼠小腸Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白m RNA表達(dá)量的影響,揭示低磷狀態(tài)下,小腸Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體m RNA表達(dá)量的變化和差異性,為低磷飼糧在生產(chǎn)上的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Phosphorus-32 Radionuclide、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒、ELISA試劑盒等,均為國(guó)產(chǎn)分析純。超速冷凍離心機(jī)（H itachiSCR20BC,日本津島）、AB7900HT Fast Real-Tim e PCR System（美國(guó)）、液體閃爍放射性儀（1450 M icrobeta,PerkinElmer）、Thermo Labsystems M uLtiskan M K3酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇120只體重在18～22 g的昆明大白鼠,隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)組,分別飼喂含0.2%、0.4%、0.6%、0.8%磷（總磷）的飼糧;每個(gè)組設(shè)5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6只大白鼠,飼糧參照大白鼠營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制[5],基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets（air-d ry basis,%）

1.3 樣品采集

試驗(yàn)期為14 d。試驗(yàn)期結(jié)束,屠宰大鼠,取腿骨、血樣、腸樣、腎臟。腿骨剔除肉、軟組織后待測(cè)骨鈣及骨磷;血樣于3 000 r/min離心后取血清并置-20℃冰箱保存,備測(cè)生化指標(biāo);截取十二指腸、空腸中段和回腸,排出內(nèi)容物,外翻腸道,用生理冰鹽水（0.9%NaCl）沖洗,置液氮中保存。

1.4 小腸刷狀緣膜（brush-border membrane vesicles,BBMV）的制備

按照Schroder等[6]的方法制得BBMV,并測(cè)定BBMV中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、Na+-K+-ATP酶的活性,以確定所制樣品的純度。

1.5 熒光定量PCR（real-time PCR）

Na+/Pi-Ⅱb引物參考已知大鼠（AF157026） CDS保守序列設(shè)計(jì)。上游引物為:5′-GTCCTCGTCAATCATCGTCAG-3′,下游引物為:5′-GCATAAGTGCCACAATCGTGTT-3′,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為123 bp;β-actin（NM 031144）:上游引物為5′-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,下游引物為5′-GCTAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′, PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為112 bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系為:5μL 1×qPCR mix,上下游引物（10μmo l/L）各0.3μL,DNA溶液0.5μL,50×ROX 0.2μL,加滅菌蒸餾水至10μL。循環(huán)反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性60 s;95℃PCR變性15 s;60℃下延伸30 s;退火溫度60℃;40個(gè)循環(huán)。

1.6 BBMV對(duì)于磷轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的測(cè)定

采用放射性32P技術(shù),參考Schroder等[7]和孫杰[8]的方法并加以改進(jìn)。將20μL囊泡懸浮液加到80μL含有1 uCi32P的轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液中,于25℃水浴鍋中孵浴60 s,接著用2m L冰冷的終止緩沖液（含10 mm ol KH2 PO4的10 mmol HEPES-tris、100mmo l NaCl、100mmo l甘露醇,pH 7.4）終止反應(yīng)。10 000 r/m in離心5 m in,棄上清液。加入1 m L甲醇溶液,加入0.36 m L閃爍液體,于β射線（液體閃爍計(jì)數(shù)）放射性測(cè)定儀測(cè)量放射強(qiáng)度,并測(cè)定80μL轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液中32Pi總放射性。鈉依賴型磷的攝入量為NaCl存在的情況下磷的攝入量與KCl存在的情況下磷的攝入量的差值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

mRNA表達(dá)量用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析;試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì);采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較;結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;以P＜0.05或P＜0.01作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同磷水平對(duì)血液和骨骼中鈣磷含量的影響

不同磷水平對(duì)血液和骨骼中鈣磷含量的影響見(jiàn)表2。不同磷水平對(duì)骨鈣、骨磷含量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）,但低磷組骨鈣含量比其他3個(gè)處理分別高1.6%、2.4%和1.1%。血清中磷的含量隨著添加磷水平的增加而升高,Ⅰ組與Ⅳ組、Ⅱ組與Ⅳ組比較差異均顯著（P＜0.05）。血清鈣含量隨磷水平的增高而升高,但各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同磷水平對(duì)骨鈣骨磷和血鈣血磷的影響Table 2 Effects o f phosphate levels on calcium and phosphate in bone or serum

2.2 不同磷水平對(duì)血液生化指標(biāo)的影響

不同磷水平對(duì)血清維生素D3（vitam in D3, VD3）、甲狀旁腺素（parathyroid horm one,PTH）、ALP含量的影響均顯著（P＜0.05）。Ⅰ組血清中VD3的含量與其他3個(gè)處理比較,分別提高14.15%、12.44%、14.35%,差異顯著（P＜0.05）。Ⅰ組提高了血清中PTH含量,與Ⅳ組比較差異顯著（P＜0.05）;Ⅰ組和Ⅱ組血清中ALP與Ⅲ組和Ⅳ組比較差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同磷水平對(duì)血清維生素D3、PTH和ALP的影響Table 3 Ef fects of phosphate levels on VD 3,PTH and ALP in serum

2.3 磷水平對(duì)Na+/PiⅡb型轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白mRNA表達(dá)量的影響

不同磷水平顯著影響Na+/PiⅡb m RNA表達(dá)量（P＜0.05）。Ⅰ組回腸、空腸、十二指腸Na+/PiⅡb m RNA表達(dá)量分別是Ⅲ組的3.10（P＜0.01）、3.07（P＜0.01）、2.17倍（P＜0.05）,但對(duì)十二指腸影響不顯著（P＞0.05）,見(jiàn)圖1（A）。Ⅰ組腎臟Na+/PiⅡb m RNA表達(dá)量比其他3個(gè)磷水平組分別低9.19、12.86、23.15倍,差異均極顯著（P＜0.01）,但隨著磷水平的增高有上升趨勢(shì),Ⅳ組分別比Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組高23.15（P＜0.01）、2.15（P＜0.05）、1.79倍（P＜0.05）,見(jiàn)圖1（B）。不同的磷水平顯著影響Na+/PiⅡb mRNA在小腸不同部位和腎臟中的表達(dá)。各組中均以回腸表達(dá)量最高;Ⅰ組中回腸Na+/PiⅡb m RNA表達(dá)量分別是空腸、十二指腸和腎臟的1.34（P＞0.05）、3.43（P＜0.05）和95.53倍（P＜0.01）;腎臟中Na+/PiⅡb m RNA的表達(dá)量最低,分別比空腸、十二指腸低70.92、27.85倍,差異極顯著（P＜0.01）,見(jiàn)圖2（A、B、C、D）。

2.4 不同磷水平對(duì)磷吸收的影響

不同磷水平顯著影響磷吸收（P＜0.05）?；啬c中0.2%磷水平組分別與0.6%磷水平組、0.8%磷水平組比較差異均顯著（P＜0.05）;腎臟對(duì)磷的重吸收隨飼糧磷水平的降低有下降的趨勢(shì),但各組間差異不顯著（P＞0.05）;可見(jiàn),低磷對(duì)回腸中的磷吸收影響最大,回腸是小腸中磷吸收的主要腸段;腎、十二指腸磷吸收較少。

圖3 不同磷水平對(duì)小腸BBMV中磷吸收的影響Fig.3 Effects of phosphate levels on Piup take o f BBMV

3 討論

3.1 飼糧中鈣磷比、血液生化指標(biāo)與磷吸收的關(guān)系

鈣磷比在1.5∶1～2∶1時(shí)對(duì)鈣和磷的吸收利用率最佳[1]。本試驗(yàn)中各組飼糧鈣磷比雖在正常的鈣磷比范圍內(nèi),但低磷飼糧并未降低骨組織和血清中的鈣。血清鈣和磷的含量均隨處理中磷水平的增加而升高。這與王鳳來(lái)等[9]的研究結(jié)果相一致。這說(shuō)明低磷情況下只要保持鈣磷比例適當(dāng),并不影響組織中鈣磷的吸收。

血清ALP活性能夠間接反映骨骼成骨細(xì)胞的ALP活性狀況。血清A LP易受飼糧磷水平影響,但對(duì)飼糧鈣磷比例反應(yīng)相對(duì)較弱。飼糧低磷或磷缺乏時(shí),導(dǎo)致骨組織成骨細(xì)胞增生且功能增強(qiáng),使成骨細(xì)胞中的ALP大量釋放進(jìn)入血液,從而提高血清ALP活性[10]。PTH是一種調(diào)節(jié)磷酸鹽含量的主要激素,通過(guò)抑制刷狀緣膜上鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),減少對(duì)磷的重吸收。它也能直接作用于腎小管細(xì)胞以增加腎小管對(duì)磷的重吸收[11-12]。1,25-（OH）2-D3能作用于甲狀旁腺使其減少甲狀旁腺素分泌[13]。本研究中,低磷提高了血液中VD3的含量,但并未降低PTH的濃度,這與高含量VD3能夠抑制PTH的分泌、提高Na+/PiⅡb載體mRNA表達(dá)量的報(bào)道不一致,其機(jī)理可能與低磷情況下腎臟對(duì)磷重吸收的影響因素有關(guān)[14-15]。腎臟中磷的重吸收作用主要在于腎小管細(xì)胞cAM P水平,但低磷對(duì)該細(xì)胞是否有影響,還需要進(jìn)一步研究。

3.2 Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白m RNA表達(dá)量與磷吸收的關(guān)系

Na+/PiⅡb是Ⅱ型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一種重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,即小腸頂端膜鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)Pi的積累,維持細(xì)胞內(nèi)外磷平衡[2,4]。本研究中發(fā)現(xiàn),低磷條件下,大鼠回腸中Na+/PiⅡb蛋白表達(dá)最高,腎臟最低;磷的吸收也以回腸最高。這與Xu等[16]對(duì)小鼠Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究相類(lèi)似。與小腸中低磷對(duì)Na+/PiⅡb影響相反的是:低磷組降低了腎臟中Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白m RNA的表達(dá),但腎臟中磷的吸收并非最低,這可能與腎臟中調(diào)節(jié)磷重吸收的因素相關(guān)。腎臟中磷的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與腸道刷狀緣膜中Na-Pi系統(tǒng)相似,磷通過(guò)刷狀緣膜Na+/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟近端小管,磷在腎臟中的重吸收部位主要是腎小管細(xì)胞[1]。本研究中腎臟中Na+/PiⅡb載體mRNA表達(dá)量最低,但對(duì)磷的吸收能力卻比十二指腸強(qiáng),這可能是因?yàn)榈土滋岣吡四I臟中Na+/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞的活性。資料顯示,腎臟對(duì)低磷適應(yīng)的過(guò)程有2種:1）長(zhǎng)期適應(yīng),涉及到新蛋白質(zhì)的合成;2）短期適應(yīng),涉及到已存在的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)激活——鈍化反應(yīng)[2-4]。腎臟中磷重吸收的提高可能是其短期適應(yīng)的一個(gè)反映。此外,可能與Na+/PiⅡa載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān),腎臟中Na+/PiⅡa是鈉磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中另外一種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[2]。但低磷是否對(duì)其有影響,有待進(jìn)一步研究。

3.3 飼糧中維生素D3和低磷對(duì)磷吸收的影響

VD[1,25-（OH）2-D3]促進(jìn)磷的吸收,其原因主要是其可促進(jìn)小腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)治療大鼠發(fā)現(xiàn)VD[1,25-（OH）2-D3]可以刺激刷狀緣Na+/PiⅡb協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。也有學(xué)者認(rèn)為VD通過(guò)改變Na+/PiⅡb基因的表達(dá)而影響無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)效率[15]。本研究顯示,只有0.2%低磷組提高了血清中VD3的濃度,其他幾個(gè)水平組均無(wú)變化。這可能是機(jī)體在對(duì)低磷的適應(yīng)性過(guò)程中,通過(guò)刺激血漿1,25-（OH）2-D3的增高而提高了對(duì)磷的利用率[1]。

低磷可降低動(dòng)物血液和骨骼中的磷含量,血液和骨骼中的磷可作為機(jī)體磷平衡狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)。磷酸鹽通過(guò)腸細(xì)胞膜主動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程是通過(guò)Na+依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白調(diào)控進(jìn)行的“飽和過(guò)程”,其轉(zhuǎn)運(yùn)速度具有最大值,超負(fù)荷的吸收會(huì)超過(guò)載體的運(yùn)載能力,從而導(dǎo)致糞磷排出[17]。這為生產(chǎn)上提倡采用低磷飼糧提供了理論基礎(chǔ)。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體不能利用過(guò)剩的磷時(shí),磷將被排出體外,造成環(huán)境污染。低磷飼糧可提高Na+依賴型無(wú)機(jī)磷跨腸道上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的流通速度以及提高腸道刷狀緣膜對(duì)無(wú)機(jī)磷的最大轉(zhuǎn)運(yùn)速度[18]。本研究證明,飼糧中含總磷0.2%時(shí),可提高Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白m RNA的表達(dá)量,這可能與低磷提高了腸道刷狀緣膜對(duì)無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)速度以及增加了腸膜對(duì)磷的吸收有關(guān)[19]。吳信等[20]通過(guò)總磷為0.36%、0.38%、0.45%的低磷水平飼糧對(duì)不同階段生長(zhǎng)豬生產(chǎn)性能和生態(tài)環(huán)境的影響的研究也發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能并沒(méi)有降低,但糞磷排放量減少了19%～25%。

4 結(jié) 論

①低磷提高了小腸中Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白m RNA表達(dá)量和對(duì)磷的吸收。

②大白鼠Na+/PiⅡb轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白m RNA表達(dá)量以回腸最高,腎臟最低。

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（編輯 胡婷）