宋麗萍，華子春，張 欣，軒 楠，邢海燕

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000；2.南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093）

急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生常與一些不穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊及繼發(fā)血栓密切相關(guān)。這些斑塊常常并不導(dǎo)致嚴(yán)重的管腔狹窄，卻容易發(fā)生破裂、糜爛、鈣化等情況而易于繼發(fā)血栓。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并干預(yù)不穩(wěn)定斑塊，是防治急性心血管事件的關(guān)鍵。大量文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用，而膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）可與凋亡早期細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸（phosphatidyserine，PS）特異性結(jié)合[1]。因此，用99mTc標(biāo)記Annexin V可進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化（AS）病變的細(xì)胞凋亡顯像的研究。重組改良型人膜聯(lián)蛋白（H-Annexin V）是南京大學(xué)新藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室對(duì)Annexin V進(jìn)行重組技術(shù)的基礎(chǔ)上，將Annexin V的N端接入一段10個(gè)組氨酸（Histidine）結(jié)構(gòu)的多肽，從而構(gòu)建內(nèi)源性锝鰲合位點(diǎn)[2]，并不改變Annexin V的生物活性，同時(shí)又可提高其與99mTc結(jié)合效率及穩(wěn)定性。因此，本研究就是通過99mTc直接標(biāo)記 HAnnexin V，探討99mTc-H-Annexin V檢測(cè)兔AS病變的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性大耳白兔9只，體重2.5~3.5kg，均由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

試劑H-Annexin V由南京大學(xué)新藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。99mTcO4-由北京原子高科核技術(shù)有限公司提供。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器SPECT為GE公司生產(chǎn)的infinia II雙探頭可變角度帶符合線路的SPECT。GC-911型γ計(jì)數(shù)器為合肥中佳光電儀器公司。

1.2 方法

兔AS斑塊模型的制備：9只雄性大耳白兔，體重2.5~ 3.5kg。隨機(jī)分為球囊損傷組、單純高脂飼料組和正常對(duì)照組，每組各3只。

球囊損傷組給與高脂飲食 （內(nèi)含2%的膽固醇和5%豬油）飼養(yǎng)2周后，10%水合氯醛（3ml/kg體重）靜脈注射麻醉動(dòng)物，腹股溝區(qū)觸摸股動(dòng)脈搏動(dòng)，縱向切開皮膚，分離皮下組織，鈍性分離股動(dòng)脈、靜脈和神經(jīng)。切開股動(dòng)脈，球囊導(dǎo)管插入股動(dòng)脈，上行插入約30cm后，給球囊注入生理鹽水0.2ml，向下拖拉球囊至髂總動(dòng)脈分叉處，反復(fù)3次。縫合動(dòng)脈切口和皮膚，青霉素80萬單位腹腔注射3天，防止感染。術(shù)后繼續(xù)給予含2%膽固醇和5%豬油的高脂飼料，15周后進(jìn)行主動(dòng)脈在體和離體顯像。單純高脂飼料組給予內(nèi)含2%的膽固醇和5%豬油的飼料，飼喂15周。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)15周。

99mTc-H-Annexin V的制備：取凍干品H-Annexin V 500μg以生理鹽水溶解，加入緩沖液 （50mm PBS，140mm NaCl，5%甘油，pH值為7.6），再加入約40μg還原劑SnCl2，然后在其中加入37~55.5MBq/kg99mTcO4-進(jìn)行直接標(biāo)記，混勻，條件均為常溫下震蕩，37°孵化25min，取出自然冷卻到室溫。

99mTc-H-Annexin V標(biāo)記率的測(cè)定：采用紙層析法測(cè)定標(biāo)記率，取標(biāo)記混合物用新華1號(hào)層析紙，丙酮作展開劑，點(diǎn)樣后上行展開一段距離，取出晾干，然后從原點(diǎn)下0.5cm開始，每間隔1cm將層析紙分段剪裁，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定各段放射性并計(jì)算比活度。

99mTc-H-Annexin V活體兔AS斑塊顯像：3組兔飼喂15周后進(jìn)行顯像。以10%水合氯醛（3ml/kg體重）麻醉兔后固定，自耳緣靜脈注射99mTc-H-Annexin V 37~55.5MBq/kg。注射后10、30min和1、2h行靜態(tài)平面前后位顯像。顯像儀器為美國(guó)GE公司生產(chǎn)的infinia II雙探頭可變角度帶符合線路的SPECT/CT儀，配低能高分辨型準(zhǔn)直器，能峰140keV,窗寬20%。矩陣128×128，放大倍數(shù)2.0。視野包括腹主動(dòng)脈、部分肝脾、雙腎和膀胱。并計(jì)算2小時(shí)球囊損傷組和高脂飼料組兔降主動(dòng)脈靶/非靶（T/NT）比值。

兔AS斑塊離體血管顯像及血管片段放射性測(cè)定：球囊損傷組和高脂飼料組兔活體顯像后，注射過量的10%水合氯醛處死動(dòng)物，進(jìn)行解剖。小心暴露動(dòng)物心臟與髂總動(dòng)脈分叉之間的胸腹主動(dòng)脈，清除附著于動(dòng)脈上的脂肪與組織，取出降主動(dòng)脈。沿腹側(cè)縱向剪開動(dòng)脈壁，以生理鹽水沖洗干凈后置于離體的血管按斑塊的分布剪成若干等份，每段血管用電子天平稱質(zhì)量并用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每毫克組織放射性強(qiáng)度（cpm/mg）。

病理結(jié)果：將離體血管標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用±s表示，T/NT及AS斑塊的血管片段放射性攝取的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS模型的制備

經(jīng)球囊損傷血管內(nèi)皮及高脂飲食后，15周后球囊損傷組AS模型制備成功。光學(xué)顯微鏡下可見纖維帽形成，脂質(zhì)壞死中心，細(xì)胞外基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞很少（圖1）。

單純高脂飼料組AS模型：光學(xué)顯微鏡下可見病變血管壁內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞堆積，平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)增多（圖2）。

2.2 99mTc-H-Annexin V的標(biāo)記結(jié)果

標(biāo)記率為95.23%~96.15%，平均為95.82%±0.28%。

2.3 兔AS活體核素成像結(jié)果

顯像劑注射后10min球囊損傷組兔降主動(dòng)脈可見放射性攝取，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，顯像劑攝取增加，顯像劑注射后2h，球囊損傷組兔降主動(dòng)脈顯影最為清晰。單純高脂飼料組兔在注射顯像劑后10min可見降主動(dòng)脈放射性攝取，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，顯像劑攝取逐漸增加，注射顯像劑后2h，仍可見降主動(dòng)脈影像。而正常對(duì)照組兔在注射后10min可見主動(dòng)脈顯影，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，放射性逐漸消退，2h主動(dòng)脈顯影不清晰。注射顯像劑后2h球囊損傷組T/NT比值（2.68±0.25）明顯高于單純高脂飼料組（2.08±0.18，t=3.26，P＜0.05）和正常對(duì)照組（1.57±0.24，t=5.44，P＜0.01）（圖4~9）。

2.4 離體血管顯影結(jié)果

注射99mTc-H-Annexin V后2h處死球囊損傷組和高脂飼料組兔，解剖出主動(dòng)脈，肉眼可見主動(dòng)脈內(nèi)膜面大小不等的淡黃色斑塊樣突起。離體顯像可見：球囊損傷組影像較為清晰，而單純高脂飼料組可見降主動(dòng)脈顯影，但影像欠清晰。球囊損傷組含 AS斑塊的血管片段放射性攝取為 63.33± 14.11cpm/mg，明顯高于單純高脂飼料組含AS斑塊血管片段的放射性攝取52.08±12.39cpm/mg（t=2.17，P＜0.05）（圖10~12）。

圖10 球囊損傷組離體動(dòng)脈標(biāo)本顯像。 圖11高脂飼料組離體動(dòng)脈標(biāo)本顯像。 圖12 正常對(duì)照組離體動(dòng)脈標(biāo)本顯像。Figure 10. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging of the balloon traumatic group. Figure 11. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging in high fat diet group. Figure 12. The abdominal aorta in vitro imaging in normal control group.

3 討論

人膜聯(lián)蛋白是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白——Annexin家族成員之一，廣泛分布于機(jī)體的各種組織中，具有很多重要的生理功能。Annexin與PS具有高度親和力，一旦細(xì)胞凋亡發(fā)生，PS就快速地再分布于細(xì)胞膜表面。凋亡開始后Annexin V與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)可增加100~1000倍左右，因而Annexin V是細(xì)胞凋亡非常敏感的指標(biāo)[3]。由此，放射性標(biāo)記的Annexin V最早被研制成細(xì)胞凋亡顯像劑，用于活體監(jiān)測(cè)及定量測(cè)定細(xì)胞凋亡。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞都存在著凋亡現(xiàn)象。而細(xì)胞凋亡與不穩(wěn)定斑塊密切相關(guān)，但有研究顯示在動(dòng)物早期的動(dòng)脈內(nèi)膜病變中，發(fā)現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。由于動(dòng)脈粥樣硬化病變的不同階段存在的凋亡細(xì)胞數(shù)量不同，因此用放射性核素標(biāo)記的Annexin V可進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化病變程度的評(píng)估。Johnson等[1]報(bào)道，99mTc-Annexin V在豬動(dòng)脈粥樣硬化模型中顯示冠狀動(dòng)脈的斑塊，免疫組化結(jié)果提示，病變動(dòng)脈段的細(xì)胞凋亡率明顯高于周圍正常動(dòng)脈段及對(duì)照組的動(dòng)脈段。同時(shí)，Buck等[5]體外放射性核素顯像表明，99mTc-Annexin V的攝取量與主動(dòng)脈粥樣硬化部位血管損傷的嚴(yán)重程度、巨噬細(xì)胞凋亡的數(shù)量成正相關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化模型的制備方法有很多，由于家兔在脂代謝方面與人類有一些相似之處，是研究AS常選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采用單純高脂飼料喂養(yǎng)兔誘發(fā)AS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?shù)月就能形成早期的AS病變[6]。而通過球囊損傷動(dòng)脈并給予高脂飲食可造成不穩(wěn)定斑塊模型[7]。本實(shí)驗(yàn)單純高脂飼料組AS模型在光學(xué)顯微鏡下可見病變血管壁內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜性泡沫細(xì)胞堆積，平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)增多，為AS早期病變。球囊損傷組兔經(jīng)球囊損傷血管內(nèi)皮及高脂飲食后15周在光學(xué)顯微鏡下可見纖維帽形成，有大量的脂質(zhì)壞死中心，而細(xì)胞外基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞很少。根據(jù)美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)將動(dòng)脈粥樣硬化的組織形態(tài)學(xué)變化分型可知，球囊損傷組兔動(dòng)脈粥樣硬化模型為晚期病變纖維粥樣斑塊期。

有研究報(bào)道：多種核素曾被用于標(biāo)記Annexin V，包括99mTc、123I、124I、125I、18F等，而99mTc制備容易、 價(jià)格低廉， 適合SPECT顯像[8-9]。然而，直接用99mTc標(biāo)記的Annexin V將產(chǎn)生一些變性蛋白，且標(biāo)記率較低。以HYNIC結(jié)合放射性核素的方式標(biāo)記率高，但標(biāo)記過程較直接標(biāo)記法復(fù)雜，腎臟的攝取高。H-Annexin V是在Annexin V的生物結(jié)構(gòu)中尋找活性區(qū)域并進(jìn)行克隆得到的保持甚至于超過Annexin V生物活性的一種多肽，既保持了Annexin V對(duì)于PS的強(qiáng)親和力，又引進(jìn)了更多的結(jié)合位點(diǎn)，提高了其與99mTc的結(jié)合效率及穩(wěn)定性，而且標(biāo)記方法更加簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好[10]。

因此，本研究嘗試應(yīng)用99mTc標(biāo)記重組改良型H-Annexin V進(jìn)行兔AS病變程度評(píng)估的顯像研究，可見球囊損傷+高脂飼料組AS血管對(duì)99mTc-H-Annexin V的攝取明顯高于單純高脂飼料組及正常組的血管，顯像結(jié)果良好。AS血管標(biāo)本的離體顯像及其片段的放射性攝取測(cè)定顯示：球囊損傷組影像較為清晰，而單純高脂飼料組可見降主動(dòng)脈顯影，但影像欠清晰。球囊損傷組含AS斑塊的血管片段放射性攝取明顯高于單純高脂飼料組含AS斑塊血管片段的放射性攝取。說明隨著動(dòng)脈粥樣硬化病變程度的加重，AS部位細(xì)胞凋亡增多，病變部位99mTc-H-Annexin V的攝取也明顯增加，因此，99mTc-H-Annexin V可用于無創(chuàng)檢測(cè)AS斑塊并評(píng)估病變的嚴(yán)重程度。

[1]Johnson LL,Schofield L,Donahay T,et al.99mTc-Annexin V imaging for in vivo detection of atherosclerotic lesions in porcine coronary arteries[J].J Nucl Med,2005,46:1186-1193.

[2]Bogdanoc A,Simonova J,Weissleder R.Design of metal binding green fluorescent protein variants[J].Biochem Biophys Acta,1998, 1397:56-64.

[3]蘭曉麗，張永學(xué)，安銳，等.人膜聯(lián)蛋白V的表達(dá)及核素標(biāo)記[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，34（5）：520.

[4]Best PJ,Hasdai D,Sangioorgi G,et al.Apoptosis.Basic concepts and implications in coronary artery disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,19:14-22.

[5]Buck AK,Halter G,Schinmeister H,et al.Imaging proliferation in lung tumors with PET[J].J Nucl Med,2003,44(9):1426-1431.

[6]王曉花，章建程.動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈模型研究進(jìn)展[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，28（2）：175-177.

[7]Rekhter MD,Hicks GW,Brammer DW,et al.Animal model that mimics atherosclerotic plaque rupture[J].Circ Res,1998,83: 705-713.

[8]Lahorte CM,Vanderheyden JL,steinmetz N,et al.Apoptosis-detecting radioligands:current state of the art and future perspectives[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004,31:887-919.

[9]Zijlstra S,Gunawan J,Burchert W.Synthesis and evaluation of a18F-labelled recombinant annexin-V derivative,for identification and quantification of apoptotic cells with PET[J].Appl Radiat Isot,2003,58:201-207.

[10]賈支俊，馮雪鳳，楊翔，等.99Tcm-H-Annexin V動(dòng)物體內(nèi)分布及顯像[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)影像雜志，2008，19（1）：56-57.