張鉉哲，徐生軍

（東北農業(yè)大學農學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

由卵菌致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.) de Bary]引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產中最嚴重的病害之一[1]，在我國各地均有發(fā)生。到 1980年為止，只有墨西哥中部同時存在A1和A2兩種交配型[2]，除墨西哥以外的其它地區(qū)只發(fā)生A1交配型，因此世界各地的病菌群體組成比較單一。然而1984年在瑞士首次發(fā)現A2交配型后[3]，在世界各地陸續(xù)出現了A2交配型。在國內，1996年張志銘等[4]首次報道了在內蒙發(fā)現A2交配型，之后在我國各馬鈴薯主產區(qū)陸續(xù)報道了A2交配型的存在。據Goodwin等[5]的報道，由于有性生殖的出現，太平洋沿岸晚疫病菌的種群發(fā)生了顯著變異。因為P.infestans的線粒體DNA多態(tài)性是容易測定而且單親本遺傳的，所以它廣泛利用于鑒定病原菌群體的遺傳多態(tài)性研究[6]。Ghimire等[7]在尼泊爾通過交配型、RG57指紋和mtDNA單倍型的分析發(fā)現了11種新基因型。在韓國，Zhang等[8]利用3種分子標記測定了P.infestans的遺傳多樣性，并發(fā)現了4種同工酶基因型，一種線粒體DNA單倍型（Ⅱa）和8個RAPD類群。Gotoh等[9]通過RG 57指紋，mtDNA單倍型，兩種Allozyme基因型和交配型的分析，在日本發(fā)現了4種新的基因型。Zwankhuizen等[10]報道 1993～1996年在荷蘭分離的1 048個菌株中發(fā)現了170個新遺傳型，其中 138個是很罕見的。在中國，趙志堅等[11]利用線粒體DNA單倍型測定了 P.infestans菌株的遺傳多樣性。Zhu等[12]用篩選出的10個RAPD隨機引物對1997～2001年間采自我國9省市的82株及3株來自日本的致病疫霉DNA進行了PCR擴增，得出RAPD組群與菌株的地理來源、交配型及對瑞毒霉的敏感性無明顯相關性。

上述研究說明，在中國缺乏對晚疫病菌multilocus基因型的分析，因此本研究利用交配型、瑞毒霉敏感性、同工酶基因型和線粒體DNA單倍型系統分析黑龍江省和吉林省分離的馬鈴薯晚疫病菌的表現型和基因型。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

番茄培養(yǎng)基：800 mL蒸餾水，200 mL番茄汁，20 g瓊脂，4.5 g碳酸鈣。

選擇性培養(yǎng)基：番茄培養(yǎng)基+（氨芐青霉素500 mg·L－1，利福平50 mg·L－1，萬古霉素200 mg·L－1，匹馬霉素 100 mg·L－1，PCNB 35 mg·L－1，苯菌靈10 mg·L－1）。

1.2 病原菌分離

2006～2008年，在吉林省龍井市和黑龍江省的各馬鈴薯主產區(qū)采集具有單病斑的馬鈴薯病葉。為了病原菌分離，首先把病葉背面朝上放置在滅菌的培養(yǎng)皿，然后其上面再放0.5 cm厚的薯片。封蓋后將培養(yǎng)皿放在22℃黑暗培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)3～5d后將從薯片上長出來的菌絲轉移到選擇性培養(yǎng)基。

1.3 交配型和瑞毒霉敏感性分析

為了測定交配型的分布，利用已知交配型的標準菌株DN－3085（日本，A1）和BC－3（韓國，A2）。首先把未知交配型菌株的菌餅（直徑為7 mm）放在番茄汁瓊脂培養(yǎng)基中央，然后兩邊以3 cm距離放DN－3085（A1）和BC－3（A2）的菌餅（直徑為7 mm）。封蓋后將培養(yǎng)皿放在22℃，黑暗培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)10～15 d。用顯微鏡檢查兩菌落交界處是否有卵孢子。本試驗中利用Zhang等[13]的方法測定馬鈴薯晚疫病菌對瑞毒霉的敏感性。

1.4 同工酶基因型分析

為了分析2006～2008年分離的馬鈴薯晚疫病菌菌株的同工酶基因型，利用兩個同工酶位點6－磷酸葡萄糖異構酶（Gpi）和肽酶（Pep）。利用纖維素醋酸鹽電泳測定同工酶基因型[9]。同工酶分析的菌絲利用番茄培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌絲裝入1.5 mL微量離心管中，加入液氮冷凍后用研磨棒研碎，然后加入100μL滅菌去離子水，在4℃下13000rpm·min－1離心5 min，上清液就是酶液。利用 Goodwin等[5]報道的方法進行Gpi和Pep電泳。利用瓊脂覆蓋法完成同工酶Gpi和Pep的染色。

1.5 基因組DNA提取

利用番茄液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2006～2008年分離的馬鈴薯晚疫病菌菌株獲得菌絲，菌絲保存在－80℃冰箱。采用Goodwin等[14]報道的方法，微作改動，提取馬鈴薯晚疫病菌基因組DNA。

1.6 線粒體DNA(mtDNA)單倍型分析

利用Griffith和Shaw[15]報道的PCR－RFLP方法測定馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型，并設計4對引物組合（表1）。PCR擴增反應物由200 μM的各種dNTP，0.34 mM引物，1×緩沖液（20 mM KCl，20 mM Tris－HCl，pH 8.4，2 mM MgCl2，10 mM（NH4）2SO4，0.5 μL（1 U）的Taq DNA polymerase和20 ng的基因組DNA，最終把擴增反應物容量調至25 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性90 s，94℃變性40 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)，最終72℃下延伸120s。利用3種內切酶CfoⅠ、MspⅠ和EcoRⅠ把5 μL的擴增DNA切斷4 h以上（37℃條件下）。

表1 試驗中用于馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型測定的寡核苷酸引物Table 1 Oligonucleotide primers used to investigate mitochondrial DNA haplotypes of Phytophthors infestans

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯晚疫病菌交配型和瑞毒霉抗藥性的分析

從2006年到2008年在黑龍江省和吉林省共分離了99個馬鈴薯晚疫病菌，其中2006年和2008年在黑龍江省哈爾濱市、齊齊哈爾市、牡丹江市和佳木斯市共分離了83個菌株，2007年在吉林省龍井市分離了16個菌株（表2）。

為了表明本試驗中使用的馬鈴薯晚疫病菌的生物學特性，分析了交配型和瑞毒霉敏感性。交配型的測定結果顯示本試驗中所使用的99個菌株是A1交配型，說明A1菌株是黑龍江省和吉林省存在的優(yōu)勢交配型。瑞毒霉敏感性測定結果顯示14個菌株是敏感性菌株（14.1%），7個菌株是中抗菌株（7.1%），78個菌株是抗性菌株（78.8%）（表2）。其中黑龍江省分離的菌株，瑞毒霉敏感性測定結果顯示11株（13.3%）敏感性菌株，2株（2.4%）中抗菌株，其余70株（84.3%）是抗性菌株，而吉林省分離菌株的瑞毒霉敏感性測定結果，敏感性菌株、中抗菌株和抗性菌株分別是3（18.8%）、5（31.2%）和8（50.0%）。以上結果顯示，黑龍江省發(fā)生的馬鈴薯晚疫病菌的瑞毒霉抗性明顯高于吉林省發(fā)生的菌株。

2.2 晚疫病菌同工酶基因型和mtDNA單倍型分析

為了分析馬鈴薯晚疫病菌的同工酶基因型，本研究使用了2006～2008年從不同地區(qū)分離的99個菌株。

同工酶基因型的測定結果顯示99個致病疫霉菌株Gpi和Pep同工酶基因型譜帶為100/100、96/96；100/100、96/100；100/100、100/100三種類型，分別占被測菌株的3.0%、1.0%和96.0%。在Gpi位點上只發(fā)現1種基因型，而Pep位點上發(fā)現多種基因型，說明在Gpi位點是純合的。2006年在黑龍江省采集的馬鈴薯晚疫病菌株的Gpi和Pep同工酶基因型譜帶為100/100、100/100；2007年在吉林省分離的馬鈴薯晚疫病菌株的Gpi和Pep同工酶基因型譜帶為100/100、96/96和100/100、100/100，分別占2007年被測菌株的6.2%和93.8%；2008年在黑龍江省采集的馬鈴薯晚疫病菌株的Gpi和Pep同工酶基因型譜帶為100/100、96/96，100/100、96/100和100/100、100/100，分別占2008年被測菌株的3.1%、1.6%和95.3%。在所有采集地區(qū)都發(fā)現了同工酶基因型100/100、100/100，表明該基因型是黑龍江省和吉林省普遍存在的優(yōu)勢同工酶基因型。通過比較2006年和2008年采自黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的Gpi和Pep同工酶基因型，基因型逐步增加，表明在黑龍江省出現了“新”的基因型（表3）。

表2 2006～2008年在黑龍江省和吉林省分離的馬鈴薯晚疫病菌的交配型和瑞毒霉敏感性的分析Table 2 The analysis of mating types and metalaxyl sensitivity of Phytophthora infestans isolates collected in Heilongjiang and Jilin Provinces from 2006 to 2008.

本試驗利用三種內切酶和四種引物組合分析了99個馬鈴薯晚疫病菌的線粒體DNA基因型（圖1）。利用MspⅠ與P2引物組合和EcoRⅠ與P4引物組合分析了101個馬鈴薯晚疫病菌（包括2株標準菌株DN 3085的單游動孢子菌系：Ⅰb單倍型）的線粒體DNA單倍型。結果顯示所測定的99個菌株中共發(fā)現2種mtDNA單倍型，其中佳木斯分離的11個菌株是Ⅰa單倍型，吉林省龍井市、黑龍江省的哈爾濱市、牡丹江市和齊齊哈爾市分離的馬鈴薯晚疫病菌都顯示為Ⅱa單倍型（表3）。Ⅰa單倍型是在黑龍江省首次發(fā)現的新基因型。Ⅱa單倍型菌株是黑龍江省和吉林省存在的優(yōu)勢線粒體DNA單倍型。

2.3 馬鈴薯晚疫病菌的multi-locus基因型分析

圖1 利用3種內切酶（CfoⅠ,MspⅠ,EcoRⅠ）分別酶切由4種引物[F1-R1(P1),F2-R2(P2),F3-R3(P3),F4-R4(P4)]組合擴增后產生的線粒體DNA單倍型的圖譜Figure 1 Restriction enzyme digestion patterns of PCR products amplified from the DNA of Phytophthora infestans with the primer pairs of F1-R1(P1,cut with Cfo I),F2-R2(P2, cut with Msp I),F3-R3(P3,cut with EcoR I)and F4-R4(P4, cut with EcoR I).Amplifications were conducted with DNA from isolates representing each of the three mitochondrial DNA haplotypes(Ⅰa,Ⅰb andⅡa).Among the mtDNA haplotypes produced with each primer pair,left isⅠa haplotype,middle isⅠb haplotype and right isⅡa haplotype.

表3 2006～2008年在黑龍江省和吉林省分離的馬鈴薯晚疫病菌的同工酶基因型和線粒體DNA單倍型的分析Table 3 The analysis of allozyme genotypes and mitochondrial DNA haplotypes of Phytophthora infestans isolates collected in Heilongjiang and Jilin Provinces from 2006 to 2008

根據交配型、同工酶基因型和mtDNA單倍型，2006～2008年分離的菌株中發(fā)現了7種基因型，其中優(yōu)勢基因型是A（84.9%）。而基因型C和D只發(fā)生在單一地區(qū)（表4）。2006年和2008年哈爾濱市分離的58個菌株中共出現了2種基因型，其中優(yōu)勢基因型是A（96.6%）。2008年牡丹江市分離的12個菌株中共出現了2種基因型，其中優(yōu)勢基因型是A（91.7%）。2006年齊齊哈爾市分離的2個菌株中出現了1種基因型（A）。2008年佳木斯市分離的11個菌株中共發(fā)現了1種基因型（D）。2007年吉林省龍井市分離的16個菌株中共發(fā)現了2種基因型，其中優(yōu)勢基因型是A（93.8%）。黑龍江省分離的83個菌株中共發(fā)現了4種基因型，其中哈爾濱市和牡丹江市分離了2種基因型，反而在齊齊哈爾市和佳木斯市只發(fā)現了1種基因型。

表4 2006～2008年在黑龍江省和吉林省分離的馬鈴薯晚疫病菌中基因型與分離地區(qū)之間相互關系Table 4 The correlation between multi-locus genotypes and isolated locations among the Phytophthora infestans isolates collected from Heilongjiang and Jilin Provinces from 2006 to 2008

3 討論

3.1 馬鈴薯晚疫病菌的交配型分布和瑞毒霉敏感性

1996年張志銘等[4]首次報道了在內蒙發(fā)現A2交配型，之后朱杰華等[16]在黑龍江省發(fā)現了A2交配型。通過對黑龍江省和吉林省2006～2008年分離純化出來的99個晚疫病菌株的交配型鑒定結果顯示,黑龍江省和吉林省還未出現馬鈴薯晚疫病菌A2交配型，這與朱小瓊等[17]和金光輝等[18]的報道一致。

瑞毒霉在我國馬鈴薯晚疫病防治方面用藥歷史較長，因用藥水平、采樣地點及年份的差異，目前在中國各省份均已檢測到不同頻率的瑞毒霉抗性菌株[19]，表明中國馬鈴薯主產區(qū)的晚疫病菌對瑞毒霉產生了嚴重的抗藥性。在黑龍江省和吉林省檢測到78.8%的抗性菌株，因此瑞毒霉在這些地區(qū)繼續(xù)使用只會對病菌群體造成藥劑選擇壓力，導致瑞毒霉敏感群體越來越少，而抗性群體會急劇上升。

3.2 馬鈴薯晚疫病菌的同工酶基因型和線粒體DNA單倍型分析

目前為止，利用Gpi酶發(fā)現了14種馬鈴薯晚疫病菌的allozyme基因型[20]。本試驗對2006～2008年黑龍江省和吉林省分離的馬鈴薯晚疫病菌同工酶基因型表明Gpi和Pep基因型逐漸多樣化（表3）。在所有采集地區(qū)主要存在1種同工酶基因型（100/100，100/ 100），這說明Gpi：100/100基因型逐步代替了Gpi：86/100基因型。

Griffith和Shaw[15]的研究結果表明，當用MspⅠ酶切由P2引物組合擴增的基因組DNA時，Ⅰa和Ⅱb單倍型有相同的基因片段，不能區(qū)分Ⅰa和Ⅱb單倍型；但用EcoRⅠ酶切由P4引物組合擴增的基因組 DNA能區(qū)分Ⅰa和Ⅱb單倍型。因此，本試驗為更好分析馬鈴薯晚疫病菌的線粒體DNA使用MspⅠ與P 2和EcoRⅠ與P 4引物組合（圖1）。由于致病疫霉mtDNA是單親本遺傳，使得它成為研究致病疫霉起源進化以及系統發(fā)育的理想研究對象。一些研究認為，Ⅰb代表致病疫霉群體在第一次全球遷移之前廣泛分布的與US－1無性繁殖譜系密切相關的“舊”群體，而Ⅰa、Ⅱa和Ⅱb則為第一次全球遷移發(fā)生后在墨西哥以外出現的“新”群體[1－2,14]。本試驗中，除來自日本的標準菌株為Ⅰb線粒體DNA單倍型外，采自黑龍江省和吉林省馬鈴薯晚疫病菌的99個菌株分別是Ⅰa和Ⅱa。2006～2008年黑龍江省和吉林省占主導地位的Ⅱa基因型逐漸被Ⅰa基因型代替。這個結果類似于趙志堅等[11]介紹的云南省分離的馬鈴薯晚疫病菌中Ⅰa基因型逐漸代替Ⅱa基因型的結果，盡管兩者在群體中的分布差異顯著，但均屬于“新”群體，表明致病疫霉“新”群體已成功地替代了“舊”群體，成為黑龍江省和吉林省馬鈴薯產區(qū)的主導者，這與Akino等[21]報道的中國甘肅和河北馬鈴薯致病疫霉mtDNA單倍型的結果一致。

3.3 馬鈴薯晚疫病菌的multi-locus基因型分析

馬鈴薯晚疫病菌的multi-locus基因型分析通常使用交配型、同工酶基因型、mtDNA單倍型和RG 57指紋圖譜。Spielman等[22]報道無性繁殖系菌株的基因型聚類分析能區(qū)別“舊”和“新”的基因型。本試驗利用交配型、同工酶基因型和mtDNA單倍型發(fā)現了4種multi-locus基因型，沒有發(fā)現“舊”基因型US-1[20]。這些multi-locus基因型在交配型、同工酶基因型、mtDNA單倍型和RG 57指紋圖譜特性上不同于波蘭[23]，美國[24]發(fā)現的基因型，但此結果在同工酶基因型和mtDNA單倍型上類似于與Sujkowski等[23]和Zhang等[8]報道的新基因型（Gpi：100/100, Pep:100/100,Ⅱa）逐步代替“舊”基因型（Gpi：86/ 100，Pep：92/100，Ⅰb）的結果。這說明馬鈴薯晚疫病菌“新”基因型已成功地替代了“舊”基因型，成為黑龍江省和吉林省馬鈴薯產區(qū)的主導者。

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