于仙萍，陳 煒，卞春松，金黎平*

（1.寧夏涇源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏 涇源 756400；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

馬鈴薯脫毒技術(shù)的應(yīng)用與推廣，解決了長(zhǎng)期以來(lái)困擾馬鈴薯生產(chǎn)中的病毒性退化問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)馬鈴薯脫毒種薯增產(chǎn)效果顯著，一般增產(chǎn)幅度可達(dá)30%～50%[1]。馬鈴薯莖尖剝離技術(shù)是獲得脫毒種薯目前最直接、最有效的途徑，但是馬鈴薯塊莖通過(guò)莖尖剝離后，有些病毒不能一次脫除，要對(duì)試管苗進(jìn)行再次莖尖剝離，在此項(xiàng)技術(shù)中，馬鈴薯莖尖成苗率高低是莖尖剝離技術(shù)的關(guān)鍵。對(duì)馬鈴薯試管苗進(jìn)行熱處理和病毒唑處理，結(jié)合莖尖培養(yǎng)可達(dá)到較高的脫毒率，但就其對(duì)莖尖成苗率影響方面的研究較少。本試驗(yàn)旨在對(duì)帶病毒的馬鈴薯試管苗進(jìn)行熱處理和病毒唑處理，再剝離莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究不同處理方法對(duì)馬鈴薯莖尖成苗率的影響，為獲得較多數(shù)量的脫毒馬鈴薯苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2009年3～6月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馬鈴薯課題組的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)材料為中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉研究所育成的品系，代號(hào)為N88和D575。經(jīng) ELISA檢測(cè)，N88帶有PVY和PLRV病毒，D575帶PVS病毒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熱處理+莖尖剝離

本試驗(yàn)采用鈍化病毒的熱處理方法對(duì)試驗(yàn)材料N 88試管苗進(jìn)行不同時(shí)間段的變溫處理。熱處理設(shè)計(jì)為40℃/25℃（4 h/20 h）的變溫，時(shí)間段分為2、3、4周，變溫處理后進(jìn)行莖尖剝離，每個(gè)處理剝離60個(gè)莖尖，統(tǒng)計(jì)不同處理不同培養(yǎng)時(shí)間段的莖尖成苗率。

1.2.2 病毒唑處理+莖尖剝離

試驗(yàn)材料N88、D575的試管苗分別接種在普通MS培養(yǎng)基和加入20 mg·L－1、30 mg·L－1病毒唑的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40 d后莖尖剝離。每個(gè)處理剝離60個(gè)莖尖，統(tǒng)計(jì)不同處理的莖尖成苗率。

1.3 莖尖剝離及組織培養(yǎng)

1.3.1 莖尖剝離

經(jīng)過(guò)不同處理的試管苗莖尖，在30～40倍解剖鏡下進(jìn)行分生組織剝離，切取長(zhǎng)度為0.1～0.3 mm帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖，立即接種到莖尖培養(yǎng)基的試管中。

1.3.2 莖尖培養(yǎng)

莖尖培養(yǎng)基為MS+0.05 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1GA3+4 g·L－1瓊脂粉+30 g·L－1白砂糖的改良固體培養(yǎng)基，莖尖分生組織在20～23℃，1 800～2 000 lx光照強(qiáng)度，每天16 h光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)。30 d后開(kāi)始調(diào)查成苗率，每隔10 d調(diào)查1次，直到60 d。

成活莖尖長(zhǎng)出帶有兩個(gè)以上葉片的小植株記做成苗，成苗率=成苗株數(shù)／成活莖尖個(gè)數(shù)（莖尖分生組織發(fā)育為可見(jiàn)綠點(diǎn)謂之成活）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)莖尖成苗率的影響

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)的觀察記載，熱處理對(duì)試管苗影響很大，37℃恒溫處理2周后試管苗基本枯死，所以帶馬鈴薯病毒的試管苗一般不能進(jìn)行37℃以上的恒溫處理。試管苗40℃/25℃（4h/20h）變溫處理時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)剝離莖尖的成苗率有較大影響，隨著處理時(shí)間加長(zhǎng)，莖尖也受到損傷。4周變溫處理后試管苗枯死50%以上，剝離莖尖成苗率也隨之降低。

從表1可以看出，不同熱處理時(shí)間對(duì)莖尖成苗率影響較大，其中不進(jìn)行熱處理和2周變溫?zé)崽幚韯冸x莖尖成苗率較高，兩者數(shù)據(jù)很接近，30 d后調(diào)查莖尖成苗率分別為26.7%和23.3%，60 d成苗率分別為 61.7%和60.0%；4周變溫處理后剝離莖尖成苗率最低，莖尖分生組織培養(yǎng)30 d和40 d均不能成苗，50 d成苗率僅為5.0%，60 d為15.0%。

表1 不同熱處理對(duì)N88莖尖成苗率的影響(%)Table 1 Plantlet regeneration percentage of shoot tip culture of the clone N88 after the heat treatment of alternating temperature 40℃/25℃(4h/20 h)

2.2 病毒唑處理對(duì)莖尖成苗率的影響

從表2可以看出，N88材料不經(jīng)過(guò)病毒唑處理直接莖尖剝離，成苗率最高，60 d成苗率達(dá)到61.7%；經(jīng)過(guò)不同濃度病毒唑處理的莖尖成苗率在各時(shí)間段都很接近，30 d均為5.0%，而60 d為40%和41.7%。D575材料不同濃度病毒唑處理對(duì)莖尖成苗率影響較大，未經(jīng)病毒唑處理的莖尖成苗率最低，60 d僅為20%；20 mg·L－1病毒唑處理40 d后莖尖剝離成苗率很高，為63.3%，30 d成苗率為56.7%，60 d達(dá)到83.3%。

表2 不同濃度病毒唑處理對(duì)莖尖成苗率的影響Table 2 Influence of various levels of virazole on plantlet regeneration percentage of shoot tip culture

3 討論

病毒唑處理后，剝離莖尖能獲得較高的莖尖成苗率，是由于病毒唑處理過(guò)程中對(duì)試管苗培養(yǎng)影響小，莖尖沒(méi)有受到損傷。對(duì)于試驗(yàn)材料D575經(jīng)過(guò)20 mg·L－1病毒唑處理40 d后的莖尖成苗率明顯高于對(duì)照，有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。試驗(yàn)材料不同，病毒唑處理后剝離莖尖成苗率有一定的差異，材料D575在不同的培養(yǎng)階段莖尖成苗率都高于材料N88。近年來(lái)，更多的研究是將某些病毒抑制劑加入培養(yǎng)基中，以提高莖尖脫毒效果。

同一材料不同的處理方法對(duì)莖尖成苗率的影響較大，材料N88經(jīng)過(guò)不同濃度病毒唑處理剝離莖尖成苗率低于2周熱處理，但相對(duì)于3、4周變溫處理的莖尖成苗率有明顯的提高。

不同處理剝離莖尖成苗后經(jīng)ELISA檢測(cè)，材料N88對(duì)照（0周）莖尖剝離PVY脫毒率為60%，PLRV脫毒率為70%，同時(shí)脫除PVY、PLRV的概率為30%；N88經(jīng)過(guò)2周變溫處理后莖尖剝離PVY、PLRV的脫毒率均為93.3%，而同時(shí)脫除PVY、PLRV的概率為86.6%；N88經(jīng)過(guò)3、4周變溫處理的剝離莖尖PVY、PLRV脫毒率為100%。N88材料在加入 20 mg·L－1、30 mg·L－1病毒唑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后莖尖剝離，PVY、PLRV的脫毒率為100%；D575材料經(jīng)過(guò)20 mg·L－1、30 mg·L－1的病毒唑處理后莖尖剝離，PVS的脫毒率均為40%，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)病毒唑處理直接莖尖剝離PVS脫毒率為0。Wambugu等[2]在培養(yǎng)基中加入20 mg·L－1病毒唑，經(jīng)5個(gè)月培養(yǎng)的 3～4 mm長(zhǎng)的莖尖，使Norchip品種脫除了89%PVY、90%PVS，說(shuō)明帶毒試管苗在加入病毒唑培養(yǎng)基中培養(yǎng)后再進(jìn)行莖尖剝離可以提高PVY脫毒率，本試驗(yàn)PVY病毒的脫毒效果與Wambugu等的試驗(yàn)結(jié)果相接近，病毒唑?qū)︸R鈴薯其它病毒的影響情況需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

[1]馬力.黑龍江省西部馬鈴薯脫毒、快繁、保種新技術(shù)[J].中國(guó)馬鈴薯,2009,23(1):44－45.

[2]Wambugu F M,Seeor G A,Gudmestad N C.Eradiction of potato virus Y and S from potato by chemotherapy of cultured axillary bud tips[J].American Potato Journal,1985,62:667－672.