鄭 義，李 超，王乃馨

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

金針菇多糖的研究進展

鄭 義，李 超，王乃馨

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

金針菇多糖是金針菇的主要活性成分之一，近年來因其抗腫瘤和調節(jié)免疫等功能成為研究的熱點。綜述金針菇多糖的提取、純化、結構和生物活性的研究進展，提出目前金針菇多糖研究中存在的問題，并對其研究方向進行展望。

金針菇；多糖；提取；純化；結構鑒定；生物活性

Abstract：As the major biological activity components,Flammulina velutipespolysaccharides have attracted tremendous attentions due to their antitumor and immunoregulation functions. Current research progress in the extraction, purification,structure characterization and biological activities of polysaccharides fromFlammulina velutipesare reviewed in this paper.Meanwhile, problems encountered during the investigations ofFlammulina velutipespolysaccharides are also discussed, which will provide a useful guidance for future studies.

Key words：Flammulina velutipes；polysaccharides；extraction；purification；structure characterization；biological activity中圖分類號：R284.2；R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)17-0425-04

金針菇(Flammulina velutipes)又名樸菇、冬菇，隸屬真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢菌屬。金針菇富含蛋白質、碳水化合物、礦物質元素、維生素和粗纖維，含脂肪較低，是一種不可多得的高營養(yǎng)食品，有增智菇和“一休菇”等美稱，目前已發(fā)展成為世界第三大食用菌。由于其含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、火菇素、火菇毒素、倍半萜等多種生物活性物質[1]，而被認為具有很高的藥用價值。金針菇多糖是金針菇的主要活性成分之一，具有抗腫瘤和免疫調節(jié)作用。本文就近年來國內外對金針菇多糖的主要研究進展，包括其提取純化、結構分析、生物活性及存在問題等作一綜述。

1 金針菇多糖的提取

食用菌多糖能溶于水、酸、堿、鹽溶液，而不溶于醇、醚、酮等有機溶劑，因而多糖的提取常采用水提醇沉法、酸堿浸提法、酶法、超聲波法、微波法和超臨界流體提取法等[2]。目前，有關金針菇多糖的提取工藝已有不少研究，基本過程如下：新鮮金針菇或金針菇干品→破碎→熱水提取(蒸餾水或稀堿液或稀酸液)或酶法提取(單一酶法或復合酶法)或超聲提取→濃縮→乙醇沉淀→去除蛋白→洗滌→干燥→金針菇粗多糖。除蛋白的方法主要有Savag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等，其中以Savag法最為常用，即采用氯仿、正丁醇處理多糖水溶液，使蛋白質成分變性沉淀，離心分離。

在上述工藝流程中，影響金針菇多糖提取率的因素較多，包括溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)以及提取方法等。吳可等[3]對金針菇子實體多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化研究，得出最佳工藝條件為：加水30倍，80℃浸提1h，乙醇終體積分數(shù)為60%～70%；氯仿與正丁醇，樣品與氯仿-正丁醇體積比分別為1:0.2和1:0.24時，蛋白質去除效果最好。李世敏等[4]對金針菇子實體多糖的提取工藝進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，結果表明，子實體多糖提取的最優(yōu)工藝為：原料先預處理，經(jīng)0.15%(占底物的質量分數(shù))的纖維素酶在40℃、pH4.5條件下水解3h，再用20倍樣品質量的水在100℃、pH6.5條件下浸提1h，過濾，濾液經(jīng)MWCO 5000的超濾膜在40℃、0.2MPa條件下濃縮至原體積的1/3后，用70%的乙醇沉淀，經(jīng)脫蛋白干燥，得到純品金針菇多糖。占建波等[5]通過單因素試驗、正交試驗，以多糖浸提率和蛋白質得率雙指標探討金針菇多糖的最佳提取條件，結果表明，溫度90℃、浸提時間4h、料液比1:30、提取兩次、pH7為金針菇多糖的最佳提取工藝條件；糖液中加入氯仿-正丁醇溶液(5:1)去除蛋白，產率達1.63%。姜寧等[6]在確定了金針菇深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件的基礎上，通過單因素試驗和正交試驗得出水浴提取金針菇菌絲體多糖的最佳工藝是：料液比1:60，水浴時間90min，水浴溫度60℃，并認為摸索最佳水浴時間是提取金針菇菌絲體多糖的技術關鍵。劉曉鵬等[7]研究了超聲輔助提取金針菇菌絲體多糖的最佳工藝，結果表明最佳工藝條件為：料液比1:100、超聲強度80W、超聲處理時間10min、浸提液pH8.0，超聲輔助法提取金針菇菌絲體多糖明顯優(yōu)于水提醇沉法。

2 金針菇多糖的純化與結構分析

純化金針菇多糖的目的是進一步除去多糖粗品中的雜質，獲得單一組分和一定相對分子質量的多糖，即多糖的分級。目前采用的純化策略主要是離子交換柱層析或凝膠過濾層析，前者根據(jù)多糖的電荷特性不同，后者根據(jù)其相對分子質量的差異。在純化過程中，一般用水、鹽或堿洗脫，硫酸-蒽酮法檢測，收集主峰多糖，即得到不同的多糖純品。多糖的結構分類沿用了蛋白質和核酸的分類方法，也可分為一級、二級、三級和四級結構，其中二、三、四級結構統(tǒng)稱多糖的高級結構，其與多糖的活性關系更加密切。結構分析方法包括X射線衍射法(XRD)、毛細管電泳法(CE)、核磁共振方法(NMR)、圓二色譜(CD)、氣-質聯(lián)用(GC-MS)、快原子轟擊質譜(FAB-MS)、原子力顯微鏡(AFM)等。

曹培讓等[8]從金針菇子實體中提取水溶性多糖，經(jīng)乙醇分級，DEAE-Sephadex A-25純化，得到化學均一性多糖PA5DE，相對分子質量4.71×105；用氣-液色譜(GLC)、紅外光譜(IR)、13C-NMR分析表明含有D-葡萄糖、D-甘露糖、D-巖藻糖；PA5DE分子可能具有分支結構，含β-型糖苷鍵，存在β(1→3)和β(1→6)型糖苷鍵連接。Leung等[9]采用薄層層析和凝膠過濾層析分析了金針菇多糖的結構，測得其相對分子質量為2.0×105左右，由β-D-(1→3)-葡聚糖組成。何國慶等[10]用高效液相色譜法從金針菇菌絲體中分離得到了4個組分的多糖，其相對分子質量分別為1.93×106、5.74×105、5.58×104和1.5×104，含量上以后兩者為主，分別占66.6%和22.8%。秦小明等[11]采用熱水抽提、三氯乙酸法脫蛋白、乙醇沉淀獲得金針菇子實體粗多糖，然后經(jīng)DEAE- Cellulose陰離子交換柱進行分離純化，得到FVCP-A、FVCP-B和FVCP-C三個多糖組分，并認為金針菇粗多糖成分主要是葡聚糖，同時還可能混有半乳糖聚糖、木糖葡聚糖或者木糖甘露聚糖等數(shù)個多糖組分。Smiderle等[12]利用熱水提取從金針菇子實體中得到了金針菇多糖，并采用GC-MS、13C-NMR、1H NMR、13C HMQC等方法分析了多糖的結構，結果表明金針菇多糖是一種以[-Glc(1→3)-]為主鏈的β-葡聚糖，相對分子質量為3.08×105，單糖物質的量比：甘露糖(Man):木糖(Xyl)=3:2。Pang等[13]通過熱水提取、陰離子交換層析從金針菇菌絲體中分離得到了一種水溶性多糖FVP-2，結構分析表明，F(xiàn)VP-2由α-D-(1→4)-葡聚糖構成，相對分子質量為1.89×104。王玉峰等[14]通過熱水提取、去蛋白、除色素、乙醇沉淀得到金針菇多糖，再通過離子交換法、凝膠柱層析法進行進一步純化得到精品FVP-1、FVP-2。運用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)，柱前衍生化高效液相色譜(PDHPLC)、IR和13C NMR等方法測定了兩種多糖的結構，F(xiàn)VP-1相對分子質量為1.48×104，F(xiàn)VP-2為2.73×104。FVP-1單糖物質的量比為：葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal):甘露糖(Man)=100:2.5:1.5；FVP-2為Glc:Gal:Man:巖藻糖(Fuc)=100:14:7:4。FVP-1主要以[α-D-Glc(1→4)-]為主鏈，帶有α-D-Glc(1→6)分支。FVP-2結構較復雜，存在多種單糖組成，葡萄糖具有α、β兩種構型，需通過其他實驗進一步分析其精確結構。

3 金針菇多糖的生物活性

3.1 免疫調節(jié)

多糖的免疫調節(jié)作用是多靶點的，幾乎遍及非特異性免疫和特異性免疫應答的各個環(huán)節(jié)[15]，多糖可通過促進干擾素(IFN)、白細胞介素類(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等細胞因子的分泌；激活巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK)和T、B淋巴細胞；促進抗體生成、激活補體系統(tǒng)、促進紅細胞免疫功能及增強網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)等作用增強機體免疫功能[16]。金針菇多糖大多也通過以上幾種途徑對機體起到免疫調節(jié)作用。陳芝蕓等[17]研究了金針菇多糖的3個組分FVP1、FVP2、FVP3對小鼠體內脾淋巴細胞轉化、NK細胞活性及IL-2產生的影響，結果表明，3種劑量的FVP1、FVP2、FVP3均能使正常與荷瘤小鼠的脾淋巴細胞轉化指數(shù)、NK細胞活性和IL-2增殖指數(shù)明顯提高。金針菇多糖FVP1對正常小鼠外周血白細胞無明顯影響，但對荷瘤小鼠則有明顯的升高白細胞的作用；還能顯著提高正常小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能[18]。常花蕾等[19]發(fā)現(xiàn)FVP可增強小鼠脾細胞及腹腔滲出細胞代謝MTT的活力，促進小鼠脾細胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2，促進小鼠腹腔滲出細胞分泌TNF-α。進一步研究表明，金針菇多糖主要作用于腹腔滲出細胞膜上的TLR4，從而激活p38MAPK信號轉導通路，活化轉錄因子NF-κB，后者啟動TNF-α基因轉錄，最終導致TNF-α的合成與分泌增加[20]。

3.2 抗腫瘤作用

食用菌多糖對腫瘤細胞無直接抑制或殺死作用，主要作為免疫反應調節(jié)劑，通過增強機體的免疫功能間接發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。金針菇多糖也是通過增強機體的免疫功能而發(fā)揮其抗腫瘤作用的。1968年，Kamasuka等[22]最先報道了金針菇多糖成分的抗腫瘤作用。Ohkuma等[23]采用熱水提取得到一種金針菇多糖EA3和一種多糖結合蛋白EA6，它們對小鼠肉瘤S180具有明顯的抑制作用，腹腔注射EA6可以顯著增強冷凍手術治療S180實體瘤的療效，EA3和EA6的抗腫瘤作用是通過提高機體免疫力實現(xiàn)的。Leung等[9]從金針菇子實體中提取出一種堿溶性多糖SFA1，鹽水蝦法表明SFA1無毒性，小鼠腹腔注射該多糖，可促進脾淋巴細胞增殖，導致腫瘤部位血管擴張和出血，SFA1對體內S180實體瘤有抑制作用，對體外S180腫瘤細胞無作用。陳芝蕓等[24]通過腹腔注射給藥，顯示5、10、20mg/(kg·d)的金針菇多糖FVP1能明顯抑制Lewis肺癌的實體瘤，并能抑制其自發(fā)性肺轉移，表明FVP1有良好的抗腫瘤活性。FVP1小劑量環(huán)磷酰胺伍用能顯著提高環(huán)磷酰胺對小鼠S180的抑瘤率，F(xiàn)VP1對環(huán)磷酰胺具有一定的增效減毒作用[25]。苗立成等[26]以小鼠肉瘤(S180)、小鼠肝癌(H22)瘤株及小鼠網(wǎng)狀細胞白血病(L615)瘤株造模，設空白對照、正常對照、給藥(高、低劑量)4組，分別考察金針菇多糖對各組小鼠抑瘤率和生存期的影響，結果顯示金針菇多糖對S180、H22小鼠的抑瘤率分別為50.69%、41.46%以上；對L615白血病小鼠生命延長率達到53.24%以上，其藥效呈劑量依賴。

4 結 語

金針菇多糖來源較穩(wěn)定、質量可控、高效低毒，是一種極具開發(fā)潛力的生物活性成分，進一步開展金針菇多糖的提取、分離純化、結構及藥理實驗研究，對藥物和食品開發(fā)以及金針菇資源的利用都具有重要的意義。

目前，有關金針菇多糖的提取主要以水提醇沉法為主，水提醇沉法操作容易、準確度高、成本低廉、適用于大規(guī)模的工業(yè)生產，但提取效率低且費時，產品純化困難且活性損失較大。新的提取工藝，如超聲波輔助萃取、微波輔助萃取、超臨界流體萃取、超濾以及膜分離等已成功用于食用菌多糖的提取，并且顯示出傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)勢，但應用于金針菇多糖提取的研究極少[6]，相信這些新技術在金針菇多糖的提取方面具有巨大的應用前景。用于衡量金針菇多糖提取方法的優(yōu)劣主要依據(jù)多糖得率的高低。一般來講，多糖得率較高，從中獲得活性成分的概率也相對提高，但需要指出的是多糖得率與活性之間并不存在一致性。因此，應選擇對活性破壞小、多糖得率相對較高的方法進行提取。

多糖的高級結構對其生物活性的影響較初級結構更為重要，這一點已經(jīng)得到大多數(shù)專家的認可。目前，對金針菇多糖結構的研究主要集中在對一級結構的分析，而對高級結構的研究較少。多糖的化學結構獨特、復雜，這就決定了高級結構(尤其是空間構象)和構效關系研究的復雜性和難度，此外高級結構的研究還受到測試手段的限制。所以在今后相當一段時間內，金針菇多糖的高級結構以及構效之間的關系，依舊會是研究的熱點和難點。

此外，隨著硒、鍺等微量元素的抗腫瘤、調節(jié)免疫等活性的發(fā)現(xiàn)，對硒、鍺等微量元素的研究成為熱點。在金針菇發(fā)酵培養(yǎng)過程中，添加硒、鍺等微量元素，經(jīng)分離純化得到的富硒金針菇多糖[27-28]、富鍺金針菇多糖[29-30]，可集多糖和硒(或鍺)等微量元素的生物活性于一身，具較大開發(fā)利用價值。

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Research Progress in Polysaccharides fromFlammulina velutipes

ZHENG Yi，LI Chao，WANG Nai-xin
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

2010-05-26

鄭義(1982—)，男，講師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：biozheng@gmail.com