西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽科(西安710061)

于照祥△ 陳穎慧* 劉青光

眾所周知,維 A酸是通過其核內(nèi)受體來完成其生物學功能的,其核內(nèi)受體分為二類,即維 A酸受體和異維 A酸受體。他扎羅汀作為一類合成的維 A酸受體β/γ選擇性炔類維 A酸,可誘導產(chǎn)生他扎羅汀誘導基因(Tazarotene-induced gene,TIG)1,2和3[1]。TIG2又名chemerin,是 chemR23的天 然配 體[2],由 前體prochemerin經(jīng)蛋白酶水解后生成,chemerin與其受體結合后可趨化樹突狀細胞和T細胞,一系列生理病理反應,研究表明,chemerin也可聯(lián)系內(nèi)外免疫反應。同時,TIG2可以誘導細胞產(chǎn)生 IL-8,IL-18的釋放,從而趨化抗原呈遞細胞到目的部位,調(diào)節(jié)免疫反應并促使細胞釋放更多的細胞因子和趨化因子,從而并達到抗炎和免疫監(jiān)視和免疫防御的功效。因此,本實驗檢測TIG2在正常肝組織及肝癌中的表達。

材料和方法

1 材 料 兔抗人 chemerin/TIG2單克隆抗體購于美國 Phoenix pharmaceuticals(Catalog No.G-002-52),此濃度稀釋100倍。二抗為羊抗兔IgG-HRP.原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物公司,TIG2的探針序列:5’-TTCACAAGCACCCGCCCGTGCAGTG GGCCTTCCAG-3’.5’地高辛標記,與人類其他基因無同源性收集臨床和病理確診的原發(fā)性肝癌蠟塊 30例,女14例;年齡 45～70歲,平均 56.5歲),未受累組織距腫瘤組織 3cm。19例正常組織中男11例,女8例,年齡55.4歲。此兩組年齡、性別無顯著差異性。原發(fā)性肝癌分期:Ⅰ期:未分化細胞數(shù)＜25%;Ⅱ期:未分化細胞數(shù)＞25%而＜50%;Ⅲ期:未分化細胞數(shù)＞50%而＜75%。

2 方 法

2.1 免疫組化定位檢測:新鮮組織常規(guī)固定和包埋。

2.2 KAI1免疫組化染色:已制備好的腫瘤組織切片,56℃烤片過夜,經(jīng)過二甲苯Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ各 10min,無水乙醇、95%、85%、75%乙醇梯度水化各 2 min處理,流水沖洗 2～3 min,3%甲醇過氧化氫室溫下避光孵育30 min,蒸餾水洗 2min×3次,0.01 M PBS浸泡 5 min×3次,切片用 0.01 M檸檬酸鈉緩沖液,預熱,微波(100℃)抗原修復 10 min,自然冷卻,0.01 M PBS洗5min×3次,10%正常羊血清工作液,37℃封閉 20 min,傾去,不洗,濾紙吸去封閉劑,加兔抗小鼠 TIG2親和純化抗體(Ⅰ 抗),0.01 M PBS洗 5min×3次,加羊抗兔生物素化二抗(即用型),37℃濕盒中孵育 30 min,0.01 M PBS洗 5min×3次,加 HRP標記的鏈親和素(即用型),0.01 M PBS洗 5 min×3次,37℃濕盒中孵育 30min,0.01 M PBS洗 5 min×3次,DAB顯色,顯微鏡下觀察,適時終止,自來水沖洗,蘇木精輕微復染 1～2min自來水沖洗,75%、85%、95% 無水乙醇梯度脫水各 2min,二甲苯Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ各 2min透明,中性樹脂封片,光鏡觀察陰性對照:用 PBS液代替一抗,確定有無特異性結合。

2.3 同法、同步驟處理未轉(zhuǎn)染的陰性對照組。

2.4 免疫組化染色結果的判斷標準:采用半定量積分法,即對每張切片的陽性細胞數(shù)及陽性細胞著色強度分別進行分級計分,然后根據(jù)兩項之和確定其陽性強度。陽性細胞率即陽性細胞占計數(shù)細胞的比例,每張切片以計數(shù) 10個40×10倍視野細胞為準進行觀察,根據(jù)切片上細胞著色比例的不同分別出示為:無陽性細胞或僅有 10%觀察細胞著色,計為0分;陽性細胞數(shù) 10%～25%,計為1分;陽性細胞數(shù) 25%～50%,計為2分;陽性細胞數(shù)50%～70%,計為3分;陽性細胞數(shù)70%～100%,計為4分;再結合染色強度,無著色細胞為(-),計為0分;淺黃色為(+),計為1分;棕黃色為(++),計為2分;棕褐色為(+++),計為3分;無顆粒沉積或僅出現(xiàn)片狀或均勻黃染者可能是DAB沉積,而非真正的陽性染色,應視為陰性。兩項之和0分為無表達,1～3分為低表達,4～7分為高表達。

結 果

TIG基因在正常肝組織中呈高表達,而在原發(fā)性肝癌中呈低表達,且隨著細胞分化程度的降低,TIG基因的表達量也隨之明顯降低。

討 論

研究表明,TIG2 mRNA見于皮膚,肝臟,胰腺,卵巢和大小腸中,其蛋白可見于卵巢癌,淋巴器官和紅斑狼瘡的真皮血管內(nèi)皮細胞中,而成熟 chemerin則存在于多種炎癥液和血液濾液中。catelicidin家族的chemerin可以趨化未成熟的樹突狀細胞和巨噬細胞,此兩種細胞是chemR23受體的主要表達部位。許多類型的腫瘤細胞可直接通過趨化樹突狀細胞和巨噬細胞,而腫瘤中這些細胞的增生和侵潤。TIG2在抗腫瘤方面的作用逐漸受到越來越多的重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),TIG2在皮膚癌,非小細胞肺癌中均表達降低,且與腫瘤的分化程度及病理分期關系密切。作者假設,腫瘤起始階段,不良刺激是非活化的prochemerin在蛋白水解酶的作用下,分泌出成熟chemerin,其可趨化抗原呈遞細胞(APC)的聚集,導致特異性免疫以對抗腫瘤。

綜上所述,TIG基因在正常肝組織中呈高表達,而在原發(fā)性肝癌中呈低表達,且隨著細胞分化程度的降低,TIG基因的表達量也隨之明顯降低;同時,TIG可以誘導細胞產(chǎn)生 IL-18,IL-8等炎癥因子的釋放,從而趨化 APC到目的部位,調(diào)節(jié)免疫反應并促使細胞釋放更多的細胞因子和趨化因子,從而達到抗炎和免疫監(jiān)視和免疫防御的功效。

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