彭繼紅，錢 榕，方昌志，熊麗紅

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

ABO定型的方法有紙片法、試管離心法、U型微板法、梯形微板法、微柱凝膠法。經(jīng)典的試管離心方法目前仍被認(rèn)為是最可信賴的ABO定型方法[1]，但同紙片法一樣不適合血站系統(tǒng)大批量的結(jié)果處理，不僅費(fèi)時(shí)，而且易出現(xiàn)人為因素所致的差錯(cuò)事故。微柱凝膠法由于利用了分子篩凝膠技術(shù)將凝集和游離的紅細(xì)胞完全隔離開(kāi)來(lái)，操作簡(jiǎn)單且可標(biāo)準(zhǔn)化操作，結(jié)果清晰可靠，便于保存，適合臨床推廣使用，但不適合于血站大批量檢測(cè)。U型微板法使用較為廣泛，相比過(guò)去的手工檢測(cè)法，已向前邁了一大步，但我們?cè)谑褂眠^(guò)程中發(fā)現(xiàn)該方法的檢測(cè)有一定的局限性。本中心新引進(jìn)Xantus加樣器與Poseidon數(shù)字血型儀聯(lián)合組成的一體機(jī)，利用梯形微板法血型檢測(cè)系統(tǒng)(采用數(shù)碼成像技術(shù))，不僅能完成ABO正反定型，且檢測(cè)反定型弱凝集狀態(tài)樣本的靈敏度較高，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2010年1月～2010年6月的無(wú)償獻(xiàn)血者全血標(biāo)本27882人份，采用EDTA-Na2抗凝。

1.2 試劑和設(shè)備 標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B血清 (批號(hào)為200903035、200911148)和標(biāo)準(zhǔn) A、B、O 紅細(xì)胞(濃度為 2 ～5% ， 批 號(hào) 為 201001014、201002031、201003036、201003054、201004058、201006103、201007111、201008124)均由北京金豪生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。Xantus加樣器與Poseidon數(shù)字血型儀一體機(jī)(深圳愛(ài)康公司)。

1.3 方法 用全自動(dòng)加樣系統(tǒng)將標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞和待檢血漿分別加入梯形微板中，振蕩混勻，靜置反應(yīng)后，用數(shù)字血型分析儀讀板。分析反應(yīng)圖像，根據(jù)ABO血型定型原則判定反定型結(jié)果。

根據(jù)血型判讀儀已設(shè)定的凝集與非凝集臨界值，隨機(jī)選用常規(guī)A、B、O、AB型血樣各15份，5ml/份，對(duì)標(biāo)本紅細(xì)胞稀釋濃度、標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋度、紅細(xì)胞與血漿加樣比例、反應(yīng)靜置時(shí)間采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)，記錄在各種參數(shù)條件下正確判讀血型的血樣數(shù)，再通過(guò)綜合分析得出試驗(yàn)最佳條件。

1.3.1 反定型試驗(yàn)條件 加樣比例，標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞37μl和標(biāo)本血漿13μl、標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞30μl和標(biāo)本血漿 20μl、標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 25μl和標(biāo)本血漿 25μl；震蕩后在室溫(18～25℃)分別靜置 45、60、75min。

1.3.2 正定型試驗(yàn)條件 應(yīng)正、反定型試驗(yàn)在同一塊微板上試驗(yàn)，所以靜置時(shí)間定為1h，考慮以下因素對(duì)試驗(yàn)的影響。標(biāo)本紅細(xì)胞稀釋濃度設(shè)為2%、2.5%、3.0%；標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋度為 1:7、1:10、1:13；加樣比例，標(biāo)本紅細(xì)胞37μl和標(biāo)本血漿13μl、標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 30μl和標(biāo)本血漿 20μl、標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 25μl和標(biāo)本血漿 25μl。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件 標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 37μl和標(biāo)本血漿13μl靜置60分鐘為正定型最佳條件；2%標(biāo)本紅細(xì)胞稀釋濃度、1:10標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋度、加樣比例標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞25μl和標(biāo)本血漿25μl為反定型最佳條件。

2.2 準(zhǔn)確率 采用上述最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行正反定型，27882人份一次判讀中有15例血型正反定結(jié)果出現(xiàn)異常，1例為冷凝集、2例為溶血、12例為重度脂肪血，準(zhǔn)確率為99.94%。

2.3 可重復(fù)性 隨機(jī)選用常規(guī)A、B、O、AB型血樣各15份，5ml/份，重復(fù)加樣檢測(cè)3次，每次所有標(biāo)本均能一次性判讀正確，具有良好的可重復(fù)性。

3 討論

目前血站常用的批量檢測(cè)ABO血型方法為U型微板法、梯形微板法。梯形微板技術(shù)是利用孔壁呈梯狀的特殊V字型微孔板(10×12孔)，當(dāng)相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生凝集時(shí)，會(huì)均勻分布于孔壁，未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的紅細(xì)胞則沿階梯滾落于孔底中央，形成圓點(diǎn)，Poseidon軟件將每個(gè)反應(yīng)孔分解成6300個(gè)像素點(diǎn)，并且按其白度、灰度和黑度3個(gè)區(qū)域進(jìn)行分類，分別計(jì)算出相關(guān)區(qū)域的像素?cái)?shù)量，再運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)的方法分析判斷，經(jīng)CCD系統(tǒng)圖像數(shù)字化處理后,即數(shù)碼成像后得出血型鑒定結(jié)果。U型微板法運(yùn)用酶標(biāo)儀僅在微孔直徑1個(gè)方向上讀取30～40個(gè)值，再計(jì)算相對(duì)透光率判斷血型結(jié)果。比較而言，梯型微板法的判讀方式更為完善準(zhǔn)確,其準(zhǔn)確性也優(yōu)于U型微板法。從本中心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，梯形微板法的準(zhǔn)確率達(dá)99.94%與有關(guān)報(bào)道相符[2]；具有良好的可重復(fù)性。從引起血型誤判的因素分析，溶血和脂肪血仍是影響血型檢測(cè)準(zhǔn)確率的重要因素，為保證血型的準(zhǔn)確性，對(duì)標(biāo)本的接收和處理過(guò)程至關(guān)重要。除溶血和脂肪血影響血型檢測(cè)外，加樣儀吸取的血漿樣本量少，堵針或血液樣本中纖維蛋白析出均會(huì)導(dǎo)致吸樣不成功而造成假陰性結(jié)果，因此應(yīng)做好加樣儀的日常維護(hù)與保養(yǎng)工作，并在加樣時(shí)注意觀察，防止漏加，梯形微板法操作簡(jiǎn)單，且更節(jié)約成本，如抗血清僅需U型微板法的1/10，加之其檢測(cè)采用自然沉降反應(yīng)，無(wú)需離心和反復(fù)振蕩，使凝集反應(yīng)在靜置狀態(tài)完成，反應(yīng)時(shí)間更充裕，從而提高了弱凝集樣本的檢出率。由于正反定型在一塊梯形板上批量完成，實(shí)現(xiàn)了正反定型自動(dòng)校正，防止了錯(cuò)判和誤判。檢測(cè)結(jié)果數(shù)碼成像并數(shù)字化處理，原始數(shù)據(jù)以圖象的形式的保存并可打印，從而使血型檢測(cè)具有長(zhǎng)期的可追溯性。

[1]高 峰主編.輸血與輸血技術(shù)[M].人民衛(wèi)生出版社,2003:90-91.

[2]王福成,施之雍,蔡雋等.梯形微板技術(shù)在ABO血型檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)輸血雜志,2007,20(1):53-55.