張潤峰, 高連如 (中國人民解放軍海軍總醫(yī)院心臟中心, 北京 100048； 通訊作者,E-mail:lianru@yahoo.com.cn)

1976年 Friedenstein等報道了骨髓中存在克隆性生長的基質(zhì)細胞,1991年 Cap lan等正式將這類細胞命名為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)。BMSCs是具有自我更新、分化增殖和多向分化潛能的干細胞。許多研究顯示,骨髓以外的其他器官中也廣泛存在著結(jié)締組織干細胞,體內(nèi)所有這類干細胞統(tǒng)稱為間充質(zhì)干細胞(MSCs)。因取材方便,自身移植無免疫排斥反應,MSCs被廣泛應用在組織工程、細胞移植、基因治療等臨床方面。目前 MSCs已成為一種理想的治療心肌損傷的移植細胞[1]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),MSCs具有旁分泌功能[2],其治療缺血性心臟病有賴于其旁分泌作用機制[3]。MSCs的旁分泌機制主要表現(xiàn)為促進新生血管生成、抗心肌細胞凋亡、趨化其他細胞參與心肌修復等 3個方面。本文就 MSCs修復心肌的旁分泌作用機制進行綜述。

1 MSCs分泌多種生物活性因子

最近研究顯示,MSCs至少分泌 34種蛋白質(zhì)[4]；其中分泌 10種不同的生長因子,10種不同的細胞因子、化學趨化因子及其他的蛋白質(zhì)。MSCs所分泌的這些蛋白質(zhì)類物質(zhì)對組織的修復具有不可估量的作用[5]。

1.1 分泌生長因子及其受體 Kinnaird等研究證實[6],MSCs可表達促血管生成素 1/2(Ang 1/2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PGF)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板源生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 -β(TGF-β)、胰島素樣生長因子 (IGF-1)、生長激素(GH)和肝細胞生長因子(HGF)等多種生長因子。這些生長因子參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖、營養(yǎng)、支持、存活、遷移、歸巢、分化和表型等多種細胞反應。

MSCs同時還可表達多種生長因子受體,如MSCs表達 VEGF受體 -1(VEGFR-1)；人 MSCs表達的 VEGFR-1介導了該細胞對血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)的反應[2]。

1.2 分泌多種細胞因子和化學趨化因子 人類ESCs可分泌多種細胞因子,如趨化因子(CXCL6)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、化學增活素(GRO-a)、NCC4、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IFGBP)、IL-1β、白細胞抑制因子、單核細胞化學趨化蛋白 -1(MCP1)、巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)等,其調(diào)節(jié)功能涉及代謝、防御反應和組織分化[7]。移植大鼠骨髓 MSCs誘導缺血腎臟 IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子下調(diào),而 IL-10、TGF-α明顯上調(diào),從而減輕腎臟損傷[8]。

BMSCs主要高度表達與成骨細胞黏附和血管生成及重塑有關的因子,包括Ⅰ型膠元、纖維粘連蛋白(fibronectin)、層粘蛋白(laminin)和玻連蛋白(vitr onectin)[2]。人類 MSCs表達整合素 α2、α4、α5和 β1等,介導干細胞黏附到內(nèi)皮細胞,參與細胞保護[9]。

1.3 分泌調(diào)節(jié)肽 未分化的 MSCs表達腎上腺髓質(zhì)素(ADM)、降鈣素、降鈣素基因相關肽(CGRP)等的 mRNA；IL-1β和多糖均能誘導脂肪源 MSCs表達降鈣素、CGRP和 ADM[2]。脂肪 MSCs還表達局部腎素 -血管緊張素系統(tǒng)中的腎素、血管緊張素受體、血管緊張素和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶[10]。BMSCs可分泌心鈉素、腦鈉素等細胞活性物質(zhì)[11]。

1.4 分泌干細胞特異性活性因子 干細胞還產(chǎn)生一些特異性活性因子,不僅調(diào)節(jié)干細胞自身的存活、遷移、歸巢和增殖等過程,還調(diào)節(jié)靶組織的功能與修復。這些因子包括干細胞因子(SCF)、干細胞衍生因子(SDF-1)等[2]。

SDF-1是 G蛋白偶聯(lián)受體 CXCR4的配體,干細胞不僅分泌SDF-1,還表達CXCR4,SDF-1及其受體 CXCR4通過 SDF/CXCR4信號途徑抑制 MSCs凋亡,并在干細胞動員和歸巢中具有重要作用。大鼠急性心肌梗死后尾靜脈注射過表達 SDF-1的 MSCs后心功能改善的程度明顯高于 MSCs注射組,并增加梗死區(qū)心肌細胞存活率和血管密度[12]。徐亞麗等的研究證實,MSCs通過旁分泌機制在心肌缺血區(qū)產(chǎn)生豐富的 SDF-1,并借助其強大的動員、趨化、遷移功能,促進 MSCs黏附、歸巢缺血心肌,并在局部促進血管新生,參與受損心肌的修復[13]。

2 M SCs修復心肌的旁分泌作用機制

有研究者將過表達 Akt的 MSCs移植入心肌損傷的大鼠心臟內(nèi),結(jié)果顯示 MSCs-Akt對受損心肌具有較強的修復作用,且只有少量的 MSCs分化為心肌細胞。由于 Akt可調(diào)節(jié)多種細胞因子及其分泌,因此他們提出移植入心臟部位的 MSCs的旁分泌作用有可能是 MSCs修復受損心肌的機制[14]。

Gnecchi等[15]的研究發(fā)現(xiàn),Akt-MSCs移植后 72 h內(nèi)即可觀察到心功能的改善,提示此顯著效果不可能來自于移植細胞的心肌再生作用,而只可能是移植細胞的旁分泌作用。

Dai等[16]報道,MSCs移植入心梗大鼠梗死區(qū)后3個月才能檢測到部分肌細胞血管內(nèi)皮細胞表型,而全部表型的出現(xiàn)則需 6個月時間；但在移植后 4周即可檢測到心功能增強。由此推測,移植的 MSCs通過旁分泌途徑參與了早期心功能的改善。Tang等[17]將 MSCs注射到心梗大鼠的梗死邊緣區(qū),2周后 bFGF、VEGF和 SDF-1表達升高,Bax表達下降,左室收縮性明顯提高,提示 MSCs通過旁分泌作用促進了血管再生并抑制心肌細胞凋亡,從而改善了心功能。

干細胞心臟移植的有益作用是由于旁分泌機制,還是由于其增殖分化產(chǎn)生新的心肌樣細胞所致,一直是干細胞研究爭論的熱點問題。上述研究結(jié)果有力地證明了 MSCs旁分泌作用的存在；隨著干細胞旁分泌效應機制的深入研究,人們開始傾向于從干細胞旁分泌作用上解釋其移植效應。MSCs修復心肌的旁分泌效應機制研究進展如下。

2.1 提高梗死心肌 MSCs移植存活率 MSCs是用于治療心肌梗死的供體細胞,但低存活率和移植后低成功生長率始終限制其應用。美國加州大學Pons等[18]研究發(fā)現(xiàn),VEGF可減輕 MSCs應激,增加促 MSCs存活因子以及磷酸化 Akt和 Bcl-xL蛋白表達,促進 MSCs增殖。MSCs與 VEGF一起作用于梗死心臟,可明顯增加 MSCs的移植成功生長率,進而改善心功能。因此,通過促進 MSCs旁分泌 VEGF,即可解決 MSCs移植后低存活率問題。已有學者利用超聲聯(lián)合微泡引起的機械效應和空化效應刺激局部內(nèi)源性 VEGF的分泌；他們采用診斷超聲聯(lián)合微泡介導下經(jīng)靜脈移植 MSCs,通過 Western blot檢測VEGF蛋白定量,證實超聲 +微泡 +MSCs組的VEGF蛋白表達最高,且顯著高于經(jīng)靜脈移植 MSCs組及對照組,差異有統(tǒng)計學意義[13]。

2.2 激活心肌源干細胞 越來越多證據(jù)表明,心肌并非終末化組織,存在心肌源干細胞,可向心肌細胞分化；MSCs等外源性干細胞發(fā)揮心肌修復作用有限,最終需依靠心肌源干細胞激活、分化并遷移到心肌梗死區(qū)域重建心肌[19]。曹青等研究證實,MSCs旁分泌作用能夠促進心肌源干細胞內(nèi)心肌鈣蛋白T、縫隙連接蛋白 -43和轉(zhuǎn)化生長因子 βⅢ型受體的表達,并提高 smad2蛋白磷酸化程度,激活心肌源干細胞向心肌細胞分化[20]。

以往的研究認為,移植的干細胞雖可在梗死心肌存活,但數(shù)量少；雖可表達心肌細胞表型標記,但未能證明移植的干細胞可分化為成熟、有完全功能、與本身心肌相連、真正再生的心肌細胞。因此,MSCs通過旁分泌作用激活心肌源干細胞,使之分化為成熟的心肌細胞這一發(fā)現(xiàn),為干細胞研究提供了新的方向,也將為干細胞研究做出重大而實質(zhì)性的貢獻。

2.3 促進血管新生 移植細胞能分泌促血管生長的細胞因子如 VEGF和 bFGF,促進側(cè)支循環(huán)建立；刺激宿主心肌組織分泌 VEGF,促進原血管系統(tǒng)再生成。

Fuchs等[21]實驗證實,MSCs在體內(nèi)外均可增加局部血管內(nèi)皮生長因子的水平,從而促進局部血管的新生。Tang等[17]將體外培養(yǎng)的 MSCs移植到 SD大鼠冠脈結(jié)扎區(qū)域內(nèi),8周后取材行免疫組化染色計算血管密度,結(jié)果顯示 MSCs移植組大鼠急性心肌梗死區(qū)的血管密度明顯高于對照組,血管內(nèi)皮生長因子在移植組的表達顯著高于對照組。

Kennard等[22]利用大鼠的后肢制作缺血模型,然后將自體的 MSCs注射入其缺血部位。發(fā)現(xiàn)移植的干細胞分泌的血管生成因子,促進大鼠后肢血管的再生并且改善了血供。

2.4 抗細胞凋亡 Xu等[23]證實,富含 VEGF、bFGF、SDF-1、IGF-1的 BMSCs與心肌細胞共培養(yǎng)減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡。Akt基因修飾的 MSCs可以通過旁分泌的抗凋亡作用保護缺血心肌[15]。Akt-MSCs培養(yǎng)基明顯抑制缺氧誘導的細胞凋亡并觸發(fā)體外成年心肌細胞強烈的自主收縮,向缺血心肌注射該培養(yǎng)基后明顯限制心肌梗死范圍、改善心功能,表明 Akt-MSCs介導的心臟保護機制涉及MSCs的抗凋亡機制[24]。

2.5 抑制免疫炎癥反應 MSCs具有獨特的免疫抑制特性,可以抑制淋巴細胞增殖、抗原呈遞細胞的活化與成熟,移植到受體后具有一定程度的免疫抑制和炎癥調(diào)節(jié)作用。

TGF-β1是已知的具有免疫調(diào)節(jié)作用的因子。張偉等[25]研究發(fā)現(xiàn),MSCs分泌較高水平的 TGF-β1,抑制 T細胞的活化與擴增,參與多種生物過程,包括維持免疫穩(wěn)態(tài)和誘導自身耐受。

移植 MSCs可下調(diào)大鼠梗死心肌促炎細胞因子腫瘤壞死因子 -α和白細胞介素 -6的表達,上調(diào)抗炎細胞因子白細胞介素 -10的表達,提示 MSCs可調(diào)節(jié)心肌梗死后所伴隨的免疫炎癥反應,通過調(diào)節(jié)心肌梗死后的促炎/抗炎因素的平衡來保護心肌細胞,抑制心室重構(gòu)[26]。

2.6 保護和恢復細胞外基質(zhì)的完整性 Sam等[27]證實,MSCs能分泌一些基質(zhì)成分修復受損傷的宿主細胞外基質(zhì),從而恢復宿主心肌細胞的結(jié)構(gòu)性支撐,限制梗死區(qū)域的擴大和改善梗死局部的收縮功能。韓瑜等[28]的研究表明,大鼠 BMSCs的缺氧和無血清條件培養(yǎng)液能夠通過旁分泌刺激心臟成纖維細胞自身合成膠原能力的增強,提示移植到缺血心肌缺血區(qū)的 BMSCs可能通過旁分泌作用影響心臟成纖維細胞的膠原合成,從而參與心肌的修復。

3 影響 MSCs旁分泌效應的因素

3.1 缺氧 缺氧是誘導干細胞分泌功能的重要刺激因素。人類 MSCs在單純?nèi)毖鯒l件下可分泌多種細胞因子,如 FGF-2、FGF-7、IL-1、IL-6、TGF-b、TNF-α、VEGF等。缺氧激活 MSCs釋放 VEGF是通過STAT3和 p38MAPK途徑介導,STAT3基因敲除小鼠缺氧誘導的 MSCs分泌功能下降[2]。

與常氧相比,缺氧可顯著促進 Akt蛋白表達,提示缺氧雖可致細胞凋亡、增殖滯緩,但仍可促進 Akt較強表達,提示 MSCs在缺氧環(huán)境下,可能通過提高Akt的“保護性”機制而參與細胞增殖、減輕細胞凋亡等[29]。

MSCs對單純?nèi)毖鯎p害較耐受,缺氧后促紅細胞生成素信號通路的主要成分均顯著上調(diào),提示促紅細胞生成素信號通路在 MSCs耐缺氧和旁分泌保護能力中起著重要作用[30]。

3.2 機械力的牽拉 機械力的牽拉會引起心肌細胞基因表達,蛋白合成增加,改變心肌細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導；因此,機械牽拉也會在某種程度上對具有成肌分化潛能的 MSCs的基因表達與蛋白合成產(chǎn)生一定影響。

3.3 生長因子和細胞因子 MSCs的分泌功能受生長因子和細胞因子調(diào)節(jié)。TGF-β下調(diào) MSCs中MCP-5表達,該作用在小鼠股動脈結(jié)扎致后肢缺血模型上得到證實。TNF-α刺激小鼠骨髓 MSCs分泌VEGF,并活化 p38-MAPK和 STAT3途徑；p38-MAPK抑制劑明顯抑制野生型小鼠 TNF-α誘導的 VEGF分泌[2]。

4 總結(jié)與展望

迄今為止,細胞移植產(chǎn)生臨床效果的機制仍不十分清楚。旁分泌作用在 MSCs移植過程中起著非常重要的作用。MSCs在局部缺氧、缺血微環(huán)境中,可能分泌多種生物活性因子,各種因子能夠作用于鄰近的心肌細胞和成纖維細胞,通過復雜的旁分泌途徑調(diào)節(jié)某些基因的表達,并促進血管再生及側(cè)支循環(huán)形成,抑制細胞凋亡,對降低了的臟器功能產(chǎn)生一定的代償作用。

MSCs旁分泌功能的揭示,對于人類疾病的治療具有重大而深遠的意義。相信隨著 MSCs的旁分泌功能的深入研究,人類可積極有效地調(diào)動干細胞旁分泌這種機體內(nèi)源性的調(diào)節(jié)和保護機制,有望實現(xiàn)對 MSCs存活、增殖、分化等的全方位調(diào)控；或直接應用干細胞分泌的活性因子替代細胞,治療心肌梗死,從而解決目前干細胞研究中存在的一系列問題:如心臟劇烈的炎癥反應導致干細胞無法存活,移植的干細胞的數(shù)量與活性不足,自體細胞來源受限,潛在的不安全性。

[1] 王彤,黃子通.骨髓間充質(zhì)干細胞和心血管疾病[J].中國急救醫(yī)學,2008,28(7):645-649.

[2] 劉秀華,唐朝樞.干細胞的旁分泌和自分泌功能 -基礎與臨床研究的新視角[J].生理科學進展,2008,39(3):196-203.

[3] 侯炳波.骨髓間充質(zhì)干細胞通過旁分泌作用治療心肌缺血研究進展[J].中國分子心臟病學雜志,2007,7(2):117-120.

[4] Ye NS,Chen J,Luo GA,et al.Proteom ic profiling of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by 5-azacytidine[J].Stem Cells Dev,2006,15(5):665-676.

[5] 王彤,黃子通,符岳,等.心肌梗死后 MSCs治療改進心功能及心肺復蘇結(jié)果的實驗研究[J].中山大學學報:醫(yī)學版,2007,28(5):529-534.

[6] Kinnaird T,Stabile E,Burnett MS,et al.Marrow derived stromal cellsexpress genesencoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrinemechanisms[J].Circ Res,2004,94(5):678-685.

[7] Sze SK,de Kleijn DP,Lai RC,et al.Elucidating the secretion proteome of human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells[J].Mol Cell Proteomics,2007,6:1680-1689.

[8] Togel F,Hu Z,Weiss K,et al.Administered mesenchymal stem cellsprotect against ischemic acute renal failure through differentiation independentmechanisms[J].Am JPhysiolRenal Physiol,2005,289:F31-F42.

[9] Lee RH,Kim B,Choi I,et al.Characterization and expression analysis ofmesenchymal stem cells from human bonemarrow and adipose tissue[J].Cell Physil Biochem,2004,14:311-324.

[10] Matsushita K,Wu Y,Okamot o Y,et al.Local renin angiotensin expression regulateshuman mesenchymal stem cell differentiation to adipocytes[J].Hypertension,2006,48:1095-1102.

[11] 朱洪生,連鋒,王彥婷,等.永生型骨髓間質(zhì)干細胞體外誘導為心肌樣細胞的實驗研究[J].中華心血管病雜志,2004,32(1):59-63.

[12] Zhang M,Mal N,Kiedrowski M,et al.SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic supportofcardiacmyocytes aftermyocardial infarction[J].FASEB J,2007,21(12):3197-3207.

[13] 徐亞麗,高云華,劉永亮,等.旁分泌效應聯(lián)合超聲生物學效應在 MSCs歸巢與修復缺血心肌的作用[J].中國超聲醫(yī)學雜志,2009,25(10):920-923.

[14] Pittenger M,Mackay AM,Beck SC,etal.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[15] Gnecchi M,He H,Liang OD,et al.Paracrine action accounts for marked protection of ischem ic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells[J].Nat Med,2005,11(4):367-368.

[16] DaiW,Hale SL,Martin BJ,et al.Allogeneicmesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium:short and long term effects[J].Circulation,2005,112(2):214-231.

[17] Tang YL,Zhao Q,Qin X,et al.Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model ofmyocardial infarction[J].Ann Thorac Surg,2005,80(1):229-236.

[18] Pons J,Huang Y,Arakawa-Hovt J,et al.VEGF improves survival ofmensenchymal stem cells in infracted hearts[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,376(2):419-422.

[19] 高連如.心臟細胞學治療的新進展——心肌源干細胞[J].中華醫(yī)學雜志,2007,87(44):3097-3099.

[20] 曹青,王飛,林繼生,等.骨髓間充質(zhì)干細胞對 CD 117+心臟干細胞分化過程中轉(zhuǎn)化生長因子 βⅢ型受體表達的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(36):7057-7062.

[21] Fuchs S,Baffour R,Zhou YF,et al.Transendocardial delivery of autologous bonemarrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia[J].JAm Coll Cardiol,2001,37(6):1726-1732.

[22] Kennard T,Stabile E,BurnettMS,et al.Marrow derived stromal cells expressgenes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms[J].Circ Res,2004,94(5):678-851.

[23] Xu M,Uemura R,DaiY,et al.In vitro and in vivo effectsofbone marrow stem cells on cardiac structure and function[J].JMol Cell Cardiol,2007,42(4):441-448.

[24] Gnecchi M,He H,Noiseux N,et al.Evidence supporting paracrine hypothesis forAkt-modifiedmesenchymal stem cellmediated cardiac protection and functional improvement[J].FASEB J,2006,20(6):661-669.

[25] 張偉,葛薇,李長虹,等.骨髓間充質(zhì)干細胞通過分泌 TGF-β1抑制 T細胞的增殖[J].中國免疫學雜志,2005,21(3):168-171.

[26] 杜優(yōu)優(yōu),周勝華,周滔,等.骨髓間充質(zhì)干細胞移植對心肌梗死后炎性細胞因子表達的調(diào)節(jié)[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,12(8):1440-1444.

[27] Sam J,Angoulvant D,Fazel S,et al.Heart cell implantation after myocardial infarction[J].Coron Artery Dis,2005,16(6):85-91.

[28] 韓瑜,陳曦,陳靜海,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液對心臟成纖維細胞膠原合成的影響[J].中國分子心臟病學雜志,2006,6(1):43-47.

[29] 孔宏亮,劉寧寧,霍鑫,等.缺氧對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、凋亡及葡萄糖攝取和 Akt表達的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,18(10):1374-1380.

[30] 蔣峻,魏玲,王建安.骨髓間充質(zhì)干細胞缺氧后促紅細胞生成素信號通路的改變[J].中華急診醫(yī)學雜志,2007,16(7):682-688.