王倩如

(南京市婦幼保健院,江蘇南京 210004)

毛細管電色譜 (capillary electrochromatography,CEC)是近年來發(fā)展十分迅速的一種新型分離技術(shù)。它是將常規(guī)色譜填料填充到毛細管中,或在毛細管內(nèi)表面鍵合、涂敷固定相,以電滲流(EOF)作為流動相的推動力,根據(jù)樣品中各組分在固定相和流動相間分配系數(shù)的差異和在電場中遷移速率的不同而實現(xiàn)分離的一種高效微分離技術(shù)。近年來,隨著 CEC柱制備技術(shù)、分離機制、儀器設(shè)備的不斷研究和發(fā)展,CEC已在分析領(lǐng)域中引起廣泛關(guān)注,并在有機小分子分離、環(huán)境分析、藥物分析和生化分析等方面得到應(yīng)用。本文就 CEC的研究進展、CEC整體柱制備新進展及其在藥物分析中的應(yīng)用作一概述。

1 研究進展

毛細管電色譜的發(fā)展可追溯到20世紀50年代,Mould和Synge將電場應(yīng)用到薄層液相色譜中進行寡糖分離,1974年,Pretorius等[1]首次將電場引入到高效液相色譜中,顯示出以電滲流(electroosmotic flow,簡稱 EOF)作為流動相推動力進行分離的巨大優(yōu)勢,但他們的文章在當時并未引起足夠的關(guān)注。

1990年,Tusda等人發(fā)展了毛細管電色譜連續(xù)進樣技術(shù),利用柱系統(tǒng)中同時存在的壓力流和電滲流對柱內(nèi)樣品進行了富集和分離。1995年,Guo等人首次利用溶膠-凝膠技術(shù)制備了開管毛細管電色譜柱。Lord等人發(fā)展了毛細管電色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),并將其應(yīng)用于染料分析中。1998年,Stead等人發(fā)展了毛細管電色譜柱上濃縮技術(shù),并用于血漿中甾類化合物的分析。Bayer等人首次實現(xiàn)了毛細管電色譜與核磁共振的聯(lián)用。次年,Horvath等人進一步發(fā)展了毛細管電色譜的動力學理論,對毛細管電色譜和高效液相色譜中影響柱效的各種參數(shù)進行了比較研究。Poppe等人研究了填料孔結(jié)構(gòu)對毛細管電色譜柱性能的影響。

近年來,國內(nèi)外有關(guān) CEC的分離機制、柱制備、應(yīng)用研究以及全面的綜述文章迅速增加,且隨著電色譜基本理論的進一步完善,電色譜在生化藥物的分析、制藥工業(yè)、手性藥物拆分等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。表明在分析領(lǐng)域中已出現(xiàn)毛細管電色譜這一新的研究熱點。

2 CEC整體柱制備新進展

毛細管電色譜柱在 CEC分離體系中占據(jù)最重要的地位,它具有雙重作用：一是作為固定相,承擔對分離對象的分離任務(wù);二是在其表面形成雙電層,在電場作用下產(chǎn)生電滲流,作為推動力。CEC分離柱主要分為三種類型：填充柱、開管柱和整體柱。由于篇幅所限,本文主要針對 CEC整體柱制備新進展進行介紹。

CEC整體柱可分為有機聚合物型和硅基型兩大類。

2.1 聚合物型整體柱

有機聚合物型整體柱是由單體和交聯(lián)劑在有致孔劑的存在下,在毛細管內(nèi)由自由基引發(fā)原位聚合而得。聚合物型整體柱具有制備簡單,重現(xiàn)性好,柱效高及分離快速等優(yōu)點,已在多種色譜模式下獲得了成功的應(yīng)用。

Ye等[2]采用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GM A)和亞乙基二甲基丙烯酸酯(EDM A)聚合制備了中性的聚合物整體柱,然后在聚合物表面修飾了一層胰島素用于在線消化蛋白質(zhì)。Dong等[3]借鑒了 Ye等制備聚合物整體柱的方法,采用兩性的賴氨酸修飾于柱表面,成功地應(yīng)用于 CEC分離。這種整體柱的特點在于柱內(nèi)電滲流方向可以隨 pH值的變化而變化,使得分離過程中多了一個調(diào)控分離度的參數(shù)。

2.2 硅基整體柱

由于 Tanaka研究小組[4]在硅膠整體柱制備方面的出色工作,使得這類整體柱的研究日益受到重視。

Ye等[5]制備了一種苯基氨丙基修飾的硅膠整體柱。他們首先采用 Tanaka研究小組開發(fā)的經(jīng)典制柱技術(shù)制備了硅膠整體柱,然后將3一苯基氨丙基三甲氧基硅烷溶液引入柱內(nèi),于110℃下反應(yīng) lh。與 C18修飾的普通反相柱相比,這種苯基氨丙基修飾的硅膠整體柱在 CEC模式下分離苯胺類的堿性化合物時拖尾很小。

Xie等[6]在制備獲得了硅膠整體柱后,采用3-巰基丙基三甲氧基硅烷(3-M PS)修飾整體柱,接著原位鍵合并氧化巰基為磺酸基團 ,獲得了強陽離子交換 (SCX)固定相,用來分離一受體阻滯劑和生物堿取得了210,000至340,000理論塔板 /米的高分離效率。

3 在藥物分析中的應(yīng)用

盡管毛細管電色譜(CEC)技術(shù)的發(fā)展歷史并不長,但作為一個新興的分離分析技術(shù),其研究和發(fā)展的生命力最終必將體現(xiàn)在解決一些實際樣品分離分析時所具有的優(yōu)越性,因此,CEC技術(shù)發(fā)展到一定的階段后必定會伴隨著大量的實際應(yīng)用,其結(jié)果又將促進 CEC技術(shù)的研究和開發(fā)。本文將從已有的大量文獻報道中篩選出一些比較有代表性的應(yīng)用實例進行介紹。

3.1 在手性拆分中的應(yīng)用

CEC進行手性藥物對映體拆分主要有三種方式：(1)非手性固定相結(jié)合手性添加劑流動相,手性選擇作用依靠流動相中添加的手性選擇劑產(chǎn)生。(2)手性固定相,固定相上鍵合手性選擇劑,如環(huán)糊精、蛋白等。(3)手性分子烙印固定相,進行記憶性、專一性手性分離。Wiedmer等[7]使用 BSA和溶菌酶固定的磷脂涂敷毛細管分離 D型和 L-型色氨酸,L-色氨酸的理論塔板數(shù)超過500000m-1,而 D-色氨酸的理論塔板數(shù)只用大約22,000m-1,且固定化的 BSA的對映體手性選擇性比固定化溶菌酶高。

3.2 CEC在傳統(tǒng)中藥復雜成分中的應(yīng)用

隨著毛細管電色譜的出現(xiàn)及推廣,為中藥有效成分的分離分析提供了新方法和新手段。如李海燕等[8]運用膠柬電動毛細管色譜法同時分離測定了水中鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸丁芐酯、鄰苯二甲酸二辛酯五種鄰苯二甲酸酯的標準混合物。結(jié)果表明,30 min內(nèi)五種鄰苯二甲酸酯得到了較好的分離。廖杰等[9]使用反相毛細管電色譜分離蟬翼藤山酮類化合物,并對色譜分離條件進行優(yōu)化研究。

3.3 CEC在生物大分子中的應(yīng)用

不少研究工作者開始將研究方向轉(zhuǎn)移到 CEC分離分析生物大分子。如 Bandilla等[10]使用整體柱毛細管電色譜分離模型蛋白,并表明了蛋白質(zhì)容量因子隨流動相中有機溶劑的增加而增加 ,且獲得了高分辨率。Lin等[11]使用整體柱毛細管電色譜分離寡肽(包括血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ、Sar11、Thr8血管緊縮素、催產(chǎn)素、抗利尿激素系、牛 β-酪蛋白的肽能片段、人 β-酪蛋白的肽能片段和 FMRF酰胺),并比較了模板聚合物和無模板聚合物的分離行為,指出這些寡肽的電色譜分離由電泳遷移和色譜保留介導。Asthana等[12]使用膠體聚合(N-異丙基酰胺)顆粒作為假固定相的毛細管電色譜進行 DN A突變分析,指出基于聚合(N-異丙基酰胺)的毛細管電色譜有較窄的大小分布。

3.4 CEC在環(huán)境分析中的應(yīng)用

由于化學合成工業(yè)的發(fā)展和天然化合物的開發(fā),使得環(huán)境污染越來越嚴重。據(jù)報道,被確認為環(huán)境污染物的已超過350種。因此,環(huán)境污染物的檢測和監(jiān)控已成為分析化學中重要的研究課題之一,CEC技術(shù)已開始被應(yīng)用于環(huán)境污染物的分析。如李海燕等[13]采用膠束電動毛細管電泳法同時分離測定了水中鄰苯二甲酸二甲酯(DM P)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)五種化合物。并采集實際生產(chǎn)廢水樣,運用該法測定了其中 BBP的含量。呂海霞等[14]以整體固定相作為分析柱,結(jié)合加壓毛細管電色譜一紫外檢測同時分離馬拉硫磷、二嗪農(nóng)、甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、甲基毒死蜱和毒死蜱等7種有機磷類化合物?？疾炝说榷认疵摋l件下,流動相乙腈配比、緩沖液濃度、酸度及分離電壓的影響,建立了最優(yōu)色譜分離條件。Ye等[15]使用加壓毛細管電色譜分離六種合成除蟲菊酯農(nóng)藥殘留物,且考察了緩沖液PH、有機溶劑含量、緩沖液濃度和應(yīng)用電壓在六種合成除蟲菊酯分離上的效應(yīng)。

4 展望

毛細管電色譜已廣泛應(yīng)用到氨基酸、蛋白質(zhì)、手性藥物、環(huán)境樣品等多種樣品的分析。無論是填充柱、開管柱還是發(fā)展勢頭較快的整體柱,都具有其自身的優(yōu)勢。隨著柱制備技術(shù)的改進,電色譜柱也將不斷地得到完善和發(fā)展,電色譜技術(shù)必將擁有廣闊的應(yīng)用前景和光明的未來。

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