尹磊淼，宋凱，張慶華，魏穎，王宇，徐玉東，楊永清

·論著·

大鼠鈣結(jié)合蛋白S100A9基因克隆、表達(dá)及純化研究

尹磊淼，宋凱，張慶華，魏穎，王宇，徐玉東，楊永清

目的構(gòu)建大鼠鈣結(jié)合蛋白 S100A9 的原核表達(dá)質(zhì)粒并獲得純化重組蛋白。

鈣結(jié)合蛋白質(zhì)類； 遺傳載體； 基因表達(dá)；自身免疫性疾病

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(6):405-409

S100A9 是鈣結(jié)合蛋白 S100 家族重要成員之一，功能作用廣泛，可高選擇性、高親和性結(jié)合Ca2+、Zn2+等離子，具備細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)活性，參與細(xì)胞遷移，花生四烯酸代謝，骨髓細(xì)胞成熟等生物學(xué)過程[1]。S100A9 和多種免疫性炎癥疾病密切相關(guān)，如支氣管哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、兒童幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、大細(xì)胞性動脈炎、多發(fā)性硬化等。我們課題組利用基因表達(dá)序列分析技術(shù)（serial analysis of gene expression，SAGE）發(fā)現(xiàn) S100A9 是支氣管哮喘特異性高表達(dá)標(biāo)簽之一[2-3]，而針刺治療后表達(dá)降低，故認(rèn)為 S100A9 可能參與針刺抗哮喘固醇合成和免疫調(diào)節(jié)等生物過程[4]。

本研究克隆構(gòu)建 pET-32a-S100A9 原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21(DE3) 受體菌，利用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）和不同溫度條件誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并采用親和層析法進(jìn)行蛋白純化，從而為進(jìn)一步觀察S100A9 蛋白生物學(xué)功能提供重要研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 P100 PCR 儀為美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品；Tanon Gis-2010 型數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)、Tanon EPS300 電泳系統(tǒng)為上海天能科技有限公司產(chǎn)品；THZ-03M1 空氣浴恒溫振蕩器為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；LRH-150 生化培養(yǎng)箱為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Soniprep 150超聲破碎儀為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；離心超濾管為美國 Millipore 公司產(chǎn)品；高速落地離心機(jī)為美國 Beckman Coulter 公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 原核表達(dá)載體質(zhì)粒 pET32a購自美國 Novagen 公司；E.coli BL21(DE3) 受體菌購自美國 Invitrogen 公司；離心柱型 PCR 產(chǎn)物割膠回收純化試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；離心柱型質(zhì)粒小量制備試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxoid 公司；100 mg/ml 氨芐青霉素、IPTG 均購自天根生化科技有限公司；Chelating Sepharose Fast Flow 純化柱購自美國 GE healthcare 公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因 S100A9 的擴(kuò)增 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）Genebank 數(shù)據(jù)庫中大鼠S100A9 基因 mRNA 序列（登錄號為 NM053587）設(shè)計擴(kuò)增引物。上游引物為 5’ AATGGATCCATGGCTGCCAAAACAGGAT 3’（下劃線為 BamH I 酶切位點），下游引物為 5’ AATCTCGAGCTTCCCAC AGCCTTTGC 3’（下劃線為 Xho I 酶切位點）。以正常大鼠肺組織 cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：總量 20 μl 的反應(yīng)體系于 94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共進(jìn)行 35 個循環(huán)，最后 72 ℃ 延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后割膠回收 S100A9 基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建 將 S100A9 基因回收純化產(chǎn)物和原核表達(dá)載體 pET32a 質(zhì)粒分別用 BamH I 和 Xho I 內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，運用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，16 ℃ 過夜，得到重組質(zhì)粒 pET-32a-S100A9。42 ℃ 熱激法轉(zhuǎn)化入 E.coli BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)菌。在含氨芐青霉素的平板上挑選單克隆菌落并利用菌落 PCR 進(jìn)行驗證。

1.2.3 序列分析和同源性比較 挑選上述驗證成功的陽性克隆，小量提取質(zhì)粒并測序。測序結(jié)果利用 GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行局部相似性基本查詢工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，以驗證測序結(jié)果的正確性。

1.2.4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化 取測序正確的S100A9 克隆，利用 IPTG 和不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)。聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳鑒定表達(dá)結(jié)果。選取可表達(dá)融合蛋白的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用Ni2+固相化螯合 Sepharose Fast Flow親和層析純化。配置咪唑濃度梯度為 10 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L洗脫重組蛋白，將不同濃度洗脫下來的蛋白分開收集，SDS-PAGE 電泳鑒定表達(dá)結(jié)果。選取上一步中蛋白純度高的收集管，用離心超濾管濃縮蛋白，以6 mol/L 尿素脫鹽去除咪唑。

2 結(jié)果

2.1 S100A9 基因 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增得到了 1 個約為 339 bp DNA 片段，分子量大小和預(yù)期相同，提示擴(kuò)增成功（圖 1）。

圖 1 S100A9 基因 PCR 產(chǎn)物Figure 1 PCR product of S100A9

2.2 S100A9 菌落 PCR 結(jié)果

S100A9 基因 PCR 產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后克隆重組到 pET32a 表達(dá)載體上，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落 PCR 擴(kuò)增（采用 T7 和 T7 terminator 通用引物）并用 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陰性重組表達(dá)質(zhì)粒由于無目的基因片段插入，通用引物之間距離大小仍為 754 bp，陽性重組表達(dá)質(zhì)粒則由于S100A9 基因片段插入而擴(kuò)大至約 1090 bp（插入基因分子量大小和 S100A9 相同，黑色箭頭標(biāo)記處），提示基因克隆重組成功（圖 2）。

圖 2 S100A9 菌落 PCR 結(jié)果Figure 2 Colony PCR result of S100A9

2.3 S100A9 基因測序結(jié)果

利用 BLAST 比對，提示 S100A9 基因測序結(jié)果和 NCBI Genebank 數(shù)據(jù)庫中大鼠 S100A9 mRNA 序列完全一致，提示克隆序列正確（圖 3），可以進(jìn)行下一步蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

圖 3 S100A9 基因測序結(jié)果 BLAST 比對圖Figure 3 BLAST comparison of S100A9 between result of squencing and mRNA sequence of NCBI

圖 4 pET-32a-S100A9 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)圖Figure 4 IPTG-induced protein expression of pET-32a-S100A9 plasmid

2.4 S100A9 蛋白在不同溫度下的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將構(gòu)建的 pET-32a-S100A9 原核表達(dá)載體分別在 21 ℃、25 ℃、37 ℃ 誘導(dǎo)表達(dá)（IPTG 終濃度均為 1 mmol/L）。S100A9 分子量大小為 13 kD，在 pET32a 載體上表達(dá)的融合蛋白分子量大小為32 kD（pET32a 空載誘導(dǎo)表達(dá)為 19 kD，在此做陰性對照）。經(jīng)過不同溫度梯度摸索，發(fā)現(xiàn) S100A9 蛋白在 21 ℃ 有比較強(qiáng)的表達(dá)（黑色箭頭標(biāo)記處，圖 4）。親和層析純化蛋白，在 100 mmol/L 洗脫液中獲得大量純化 S100A9 重組蛋白（圖 5）。Lowry法測蛋白濃度為 8.01 mg/ml。

圖 5 S100A9 純化蛋白電泳圖Figure 5 Electropherogram of S100A9 purified ptotein

3 討論

S100A9 參與多種細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制和信號傳導(dǎo)過程，如細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等[5]。該蛋白主要功能是抑制酪蛋白激酶 I 和 II 活性，而近年研究發(fā)現(xiàn)在免疫性炎癥、腫瘤、疼痛等疾病中均出現(xiàn) S100A9 高表達(dá)，包括囊性纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、肺臟鱗癌等[6-7]，提示 S100A9 有可能作為臨床疾病診斷新指標(biāo)。S100A9 還能通過二聚體金屬螯合作用降低 Mn2+和 Zn2+濃度，從而抑制金黃色葡萄球菌（S.aureus）生長[8]。

S100 蛋白家族成員廣泛參與調(diào)控蛋白磷酸化、鈣離子自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架動態(tài)平衡以及細(xì)胞增殖和分化[9]，是新藥靶標(biāo)候選蛋白之一。S100A9 能與喹啉-3-甲酰胺小分子特異性結(jié)合，在控制自身免疫性疾病過程中起重要作用，被認(rèn)為是一個新的用于治療人類自身免疫性疾病藥物靶標(biāo)[10]。Yohannes 等[11]通過雙向電泳發(fā)現(xiàn) S100A9蛋白在糖尿病膀胱功能異常并發(fā)癥中差異表達(dá)升高，可能和平滑肌收縮功能及炎癥相關(guān)，是治療該病潛在靶標(biāo)。Moon 等[12]通過基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)S100A8 和 S100A9 基因是乳腺上皮細(xì)胞新陳代謝功能狀態(tài)候選標(biāo)志物，可作為乳腺癌治療和預(yù)后潛在靶標(biāo)。

S100A9 蛋白分子量較小，在胞質(zhì)中表達(dá)時主要以可溶性形式存在，容易被胞內(nèi)蛋白酶降解，活性不夠穩(wěn)定，因此分離純化比較困難。本實驗采用帶有融合蛋白的 pET32a 原核表達(dá)載體，連接和轉(zhuǎn)化效率非常高，性能穩(wěn)定，特別適用于小分子蛋白基因克隆及表達(dá)研究。其次，溫度是影響蛋白原核表達(dá)效率和產(chǎn)量的重要因素之一。在基因測序證實S100A9 克隆序列正確后，優(yōu)化實驗條件，在不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá) S100A9 蛋白，發(fā)現(xiàn)在 21 ℃ 該蛋白有較大表達(dá)量。本研究最終利用 pET32a 原核表達(dá)載體上的 6 × His-Tag 序列進(jìn)行親和層析純化，獲得大量重組蛋白。

S100A9 目前在國內(nèi)研究較少，尚處于起步階段。隨著研究工作深入，它在疾病中的作用機(jī)制將會愈加清晰。S100A9 純化蛋白的獲得將為今后進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定堅實基礎(chǔ)。

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Cloning, expression and protein purification of rat calcium-binding protein S100A9

YIN Lei-miao, SONG Kai, ZHANG Qing-hua, WEI Ying, WANG Yu, XU Yu-dong, YANG Yong-qing

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression plasmid of rat calcium-binding protein S100A9 and obtain purified recombinant protein.MethodsBased on the mRNA sequence of rat calcium-binding protein S100A9, PCR primer pair were designed. The gene wasamplified and inserted into pET32a prokaryotic expression vector. After confirmatory sequencing, expression of S100A9 protein was induced by isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) at different temperatures. The protein was then identified by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and purified by affinity chromatography.ResultThe results of PCR and the sequence of recombinant plasmims pET-32a-S100A9 were consistent to the expected ones. SDS-PAGE and western blotting showed that the relative molecular weight of the expressive product was same to the expected value. The affinity chromatography purification obtain mg grade purification, and found that the recombinant proteins in the 21 ℃proteins have a strong expression.ConclusionThis study has laid a foundation for further research of biological function of S100A9.

Calcium-Binding proteins; Genetic vectors; Protein expression; Autommune disease

國家自然科學(xué)基金（81001548，30873299，30701123）；上海市教委和上海市教育發(fā)展基金會“晨光計劃”資助項目（10CG45）；上海市衛(wèi)生局青年基金（2009Y096）；上海高校優(yōu)秀青年教師科研基金（szy09022）；上海市重點學(xué)科建設(shè)項目（S30304）

200030，上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所（尹磊淼、魏穎、王宇、徐玉東、楊永清）；201203 上海，生物芯片上海國家工程研究中心（宋凱、張慶華）

楊永清，Email：dryqyang@163.com

2010-09-16

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.001

方法根據(jù)大鼠 S100A9 基因 mRNA 序列，設(shè)計 PCR 引物，常規(guī)擴(kuò)增后重組連入原核表達(dá)載體 pET32a，并進(jìn)行序列測定。利用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定結(jié)果，并親和層析純化重組蛋白。

結(jié)果PCR 擴(kuò)增獲得的條帶與預(yù)期的 DNA 表達(dá)片段大小一致，克隆構(gòu)建了 pET-32a-S100A9 原核表達(dá)載體，測序結(jié)果與預(yù)期完全一致，經(jīng)親和層析純化獲得毫克級純化重組蛋白，并發(fā)現(xiàn)該蛋白在 21 ℃ 有比較強(qiáng)的表達(dá)。

結(jié)論為進(jìn)一步探討 S100A9 蛋白生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

Author Affiliations:Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China (YIN Lei-miao, WEI Ying, WANG Yu, XU Yu-dong, YANG Yong-qing); Shanghai National Engineering Center for Biochip, Shanghai 201203, China (SONG Kai, ZHANG Qing-hua)

Correspongding Author: YANG Yong-qing, Email: dryqyang@163.com www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):405-409