孔艷，吳小紅，楊立宏，安祺，董關(guān)木，俞永新

反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測實時熒光定量PCR方法的建立

孔艷，吳小紅，楊立宏，安祺，董關(guān)木，俞永新

【摘要】

【關(guān)鍵詞】聚合酶鏈反應(yīng)； RNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(6):438-441

實時熒光定量 PCR 技術(shù)是由美國 Applied Biosysems 公司推出，在 20 世紀(jì) 90 年代發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在 PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR 過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。由于引入了熒光標(biāo)記探針提高了方法的高靈敏性，可直接監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化獲得定量結(jié)果，定量和擴增同步進(jìn)行，克服了PCR 平臺效應(yīng)的特點，能實現(xiàn)多重反應(yīng)、無污染，因此具有高精確性、高特異性、實時性和可靠性等特點。目前已被應(yīng)用于病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析以及基因表達(dá)、突變和多態(tài)性研究等多個領(lǐng)域。

反轉(zhuǎn)錄酶是所有反轉(zhuǎn)錄病毒的一個重要標(biāo)志，目前普遍應(yīng)用的檢測反轉(zhuǎn)錄病毒方法是以 PCR 為基礎(chǔ)的產(chǎn)物增強性反轉(zhuǎn)錄酶（product enhanced reverse transcriptase，PERT）活性檢測法。我們曾經(jīng)在國內(nèi)首次報道了反轉(zhuǎn)錄酶的 PERT 檢測方法，但傳統(tǒng) PERT 方法在實驗過程中容易造成污染和假陽性，并且無法做到實時監(jiān)控。為此，我們在原有方法的基礎(chǔ)上[1]，以噬菌體 MS2 RNA 為模板合成引物和探針，嘗試建立一種檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性的實時熒光定量 PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 材料

噬菌體 MS2 RNA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（AMV Rtase）、核糖核酸酶抑制劑（RNasin）均購自美國 Invitrogen 公司；定量 PCR 預(yù)混合液和 Applied Biosysems7500 型定量 PCR 儀購自美國 Applied Biosystems 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計與合成 在我們以往設(shè)計引物的基礎(chǔ)上，以噬菌體 MS2 RNA為模板設(shè)計引物 RT-1 和 RT-2。RT-1 序列為 5’ d（GCCTTAG CAGTGCCCTGTCT）3’，RT-2 序列為 5 ’d（AACAT GCTCGAGGGCCTTA）3’；再合成一條探針（Probe），并分別在其 5’ 端引入 FAM 羧基熒光素，3’ 端引入 TAMRA 熒光素，Probe 序列為 5’FAM-CCCGTGGGATGCTCCTACATGTCA-TAM RA 3’。引物和探針均由上海常茂生物化學(xué)工程有限公司合成。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)總體積為 25 μl，其中包括 10 × RT Buffer 2.5 μl、20 mmol/L RT-1 2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 1 μl、40 U/μl RNasin 0.5 μl、0.5 mmol/L DTT 0.5 μl、MS2 RNA 2 μl、25 mmol/L MgCl20.5 μl、不同稀釋度的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μl、水 14 μl，反應(yīng)條件為：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。其中以水代替 MS2 RNA 作為陰性對照，即整個反應(yīng)體系無模板。

1.2.3 實時熒光定量 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)總體積為 20 μl，其中包括定量 PCR 預(yù)混合液 10 μl、20 mmol/L RT-1 1.8 μl、20 mmol/L RT-2 1.8 μl、Probe 0.5 μl、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 cDNA 0.5 μl、水5.4 μl。加樣至 96 孔定量 PCR 反應(yīng)孔中，每個樣品同時設(shè) 3 孔。在 Applied Biosysems7500 型定量 PCR儀上擴增，擴增循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 15 s，56 ℃ 33 s，72 ℃ 40 s，共 45 個循環(huán)。

1.2.4 傳統(tǒng) PERT 方法 反應(yīng)總體積為 50 μl，其中包括 25 μl 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液（10 × RT Buffer 2.5 μl、20 mmol/L RT-1 2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 1 μl、40 U/μl RNasin 0.5 μl、0.5 mmol/L DTT 0.5 μl、MS2 RNA 2 μl、25 mmol/L MgCl20.5 μl、不同稀釋度的AMV反轉(zhuǎn)錄酶 2 μl、水 14 μl），反應(yīng)條件為：37 ℃30 min，95 ℃ 5 min，用于去除 RNasin 的活性。再加入 25 μl PCR 混合液（定量 PCR 預(yù)混合液22 μl、20 mmol/L RT-2 2 μl、RNase H 0.5 μl、Taq酶0.5 μl），PCR循環(huán)反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。反應(yīng)完畢，取 10 μl PCR 擴增產(chǎn)物行 2% 瓊脂糖凝膠電泳，加樣后 80 V 電壓下電泳 30 min，紫外線燈下觀察電泳條帶并拍照。

1.2.5 方法敏感性的測定 以市售純化的 AMV反轉(zhuǎn)錄酶為標(biāo)準(zhǔn)品，行連續(xù) 10 倍倍比稀釋至 1 × 10-1～ 1 × 10-9U/μl后，分別加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄步驟與“1.2.2”中步驟相同，取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 0.5 μl 用于實時熒光定量 PCR反應(yīng)，每個稀釋度設(shè) 3 孔。剩余的 24.5 μl 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，加水補足 25 μl 后，再加入 25 μl 的PCR 混合液，應(yīng)用傳統(tǒng) PERT 方法進(jìn)行擴增。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量 PCR 方法的敏感性

將上述含有不同稀釋度 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系，經(jīng) PCR 循環(huán)反應(yīng)，得到與理論值完全相符合的PCR 熒光值曲線。定量分析結(jié)果顯示，濃度為 1 × 10-1U/μl 的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶無擴增反應(yīng)，可能是由于酶濃度太高，反應(yīng)被抑制，無標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)。從濃度為 1 × 10-2U/μl 的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶開始出現(xiàn)擴增反應(yīng)，當(dāng) AMV 反轉(zhuǎn)錄酶濃度達(dá)到 1 × 10-8U/μl時仍可檢測到相應(yīng)的熒光值（圖 1、表 1）。

圖 1 連續(xù) 10 倍倍比稀釋 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶的實時熒光定量 PCR 曲線Figure 1 Real-time fluorescence quantitative PCR curves of 10-fold serial dilution AMV Rtase

表 1 連續(xù) 10 倍倍比稀釋 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶的實時熒光定量 PCR 熒光值Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR fluorescence of 10-fold serial dilution AMV Rtase

2.2 傳統(tǒng) PERT 方法靈敏度

上述不同稀釋度的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，經(jīng)傳統(tǒng)PERT 方法擴增，所得擴增產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳后，在 112 bp 處觀察有無陽性條帶出現(xiàn)。結(jié)果顯示含高濃度（1 × 10-1、1 × 10-2U/μl）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶的擴增反應(yīng)被抑制，從濃度為 1 × 10-3U/μl的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶開始可見大小為 112 bp 的陽性條帶，檢測靈敏度達(dá)到 1 × 10-7U/μl（圖 2）。

圖 2 分別加入連續(xù) 10 倍倍比稀釋 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶的傳統(tǒng) PERT 方法的靈敏度Figure 2 The sensitivity of the traditional PERT method with 10-fold serial dilution AMV Rtase

3 討論

反轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴 RNA 的 DNA 聚合酶，是反轉(zhuǎn)錄病毒特有的一種酶類，凡是反轉(zhuǎn)錄病毒中均攜帶反轉(zhuǎn)錄酶，通過檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性指標(biāo)可達(dá)到監(jiān)測生物制品反轉(zhuǎn)錄病毒污染的目的。我們根據(jù)模板噬菌體 MS2 RNA 設(shè)計引物及探針，建立了檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性的實時熒光定量 PCR 分析方法，對生物制品中反轉(zhuǎn)錄酶活性測定具有較高的應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用傳統(tǒng) PERT 方法與實時熒光定量 PCR 方法進(jìn)行比較，整個反轉(zhuǎn)錄過程一致，但是實時熒光定量 PCR 方法所使用的模板量僅為傳統(tǒng) PERT 方法的 1/50，也就是說體系中使用的反轉(zhuǎn)錄酶量是傳統(tǒng)方法的 1/50 時，靈敏度就可達(dá)到傳統(tǒng)方法的 50 倍模板量的結(jié)果，無論定性還是定量分析，目標(biāo)都是 PCR 擴增后的終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng) PCR 擴增信號放大之前的起始模板量，通過確定標(biāo)準(zhǔn)品反轉(zhuǎn)錄酶的量，間接測出底物 cDNA 模板量，得到標(biāo)準(zhǔn)熒光值曲線，從而間接推測樣品中有無反轉(zhuǎn)錄病毒污染。結(jié)果顯示 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng) PCR循環(huán)反應(yīng)后可得到與理論值完全相符合的 PCR 熒光值曲線；當(dāng) AMV 反轉(zhuǎn)錄酶稀釋到濃度為 1 × 10-8U/μl 時，仍可得到相應(yīng)的熒光值，證明具有較高的敏感性，整個實驗過程操作簡單、快捷，而且不必使用對人體有害的染色劑[2]。

由于新病毒的發(fā)現(xiàn)和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是反轉(zhuǎn)錄病毒對生物制品細(xì)胞基質(zhì)及原代細(xì)胞的潛在污染[3]，使得 WHO 多次就有關(guān)問題進(jìn)行討論，但是 WHO 目前還沒有統(tǒng)一的國際參考品以及假陽性結(jié)果等一直是困擾各個實驗室的重要問題[4]。此次，在傳統(tǒng) PERT 方法的基礎(chǔ)上，我們建立了反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 檢測方法，使得檢測靈敏度進(jìn)一步增強；并試圖通過實時熒光定量 PCR 方法，建立一套檢測標(biāo)準(zhǔn)，采用對純化的反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋后得到標(biāo)準(zhǔn)熒光值曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。與傳統(tǒng) PERT 方法比較，反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 檢測方法可直接監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化進(jìn)行定量分析，而且其高精確性和無污染性也減少了實驗過程中假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

綜上，我們所建立的檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性的實時熒光定量 PCR 方法與傳統(tǒng) PERT 方法相比，實驗操作過程簡單，所使用的起始模板量僅為傳統(tǒng)PERT 方法的 1/50，不僅能降低氣溶膠等外來核酸造成的污染，同時能通過樣品的 PCR 擴增產(chǎn)物熒光值曲線對感染病毒的數(shù)量進(jìn)行精確定量。

參考文獻(xiàn)

[1] Pyra H, B?ni J, Schüpbach J. Ultrasensitive retrovirus detection by a reverse transcriptase assay based on product enhancement. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(4):1544-1548.

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ObjectiveTo develop a real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of reverse transcriptase activity, based on the traditional product enhanced reverse transcriptase (PERT) activity detection method.

MethodsBased on phage MS2 RNA as a template to design and synthesize primers and probe, AMV reverse transcriptase standard in a continuous of 10-fold serial dilution (1 × 10-1- 1 × 10-9U/μl) were used to catalyze reverse transcription reaction in vitro and synthesize cDNA. Using real-time fluorescence quantitative PCR method to detect the amount of substrate cDNA template, obtaining the real-time fluorescence quantitative PCR curves and analyzing the relative activity of the AMV reverse transcriptase. The traditional PERT method was used to amplify cDNA, and determining the sensitivity of the method.

Results Using AMV reverse transcriptase standard in a continuous of 10-fold serial dilution to catalyze the reverse transcriptase reaction, and the real-time fluorescence quantitative PCR method to analyze the reverse transcriptase products cDNA, the standard real-time fluorescence quantitative PCR curves fully consistent with the theoretical value were obtained; the quantitative analysis showed that the concentrations of 1 × 10-2- 1 × 10-8U/μl of AMV reverse transcriptase could get the corresponding fluorescence values. After different dilutions AMV reverse transcriptase were amplified by the traditional PERT method, the results showed the concentrations of 1 × 10-3- 1 × 10-7U/μl of AMV reverse transcriptase appeared the size of 112 bp positive band, the detection sensitivity was 1 × 10-7U/μl.

ConclusionThe new real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of reverse transcriptase activity was established successfully, the operation process was simple, and with high accuracy and non-polluting, it could provide a reference for detection of biological products external contamination, and especially retrovirus contamination.

【Key words】Polymerase chain reaction; RNA-directed DNA polymerase

Author Affiliation: The National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):438-441

目的在傳統(tǒng)產(chǎn)物增強性反轉(zhuǎn)錄酶（PERT）活性檢測方法基礎(chǔ)上建立檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性的實時熒光定量 PCR 方法。方法 以噬菌體 MS2 RNA 為模板，設(shè)計、合成引物和探針，并分別以連續(xù) 10 倍倍比稀釋的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（1 × 10-1～ 1 × 10-9U/μl）標(biāo)準(zhǔn)品催化體外反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成相應(yīng)cDNA。采用實時熒光定量 PCR 法檢測底物 cDNA 模板量，并獲得相應(yīng)的 PCR 熒光值曲線，分析 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶的相對活性。同時應(yīng)用傳統(tǒng) PERT 方法對 cDNA 進(jìn)行擴增，測定該方法的靈敏度。

結(jié)果將 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù) 10 倍倍比稀釋后催化反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實時熒光定量 PCR 分析所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，結(jié)果得到與理論值完全相符合的 PCR 標(biāo)準(zhǔn)熒光值曲線；定量分析結(jié)果顯示，濃度為 1 × 10-2～ 1 × 10-8U/μl 的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶均可得到相應(yīng)的熒光值。不同稀釋度的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，經(jīng)傳統(tǒng) PERT 方法擴增后，結(jié)果顯示濃度為 1 × 10-3～ 1 × 10-7U/μl 的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶均可見大小為 112 bp 的陽性條帶，檢測靈敏度達(dá)到 1 × 10-7U/μl。結(jié)論 成功建立了基于實時熒光定量 PCR 技術(shù)的檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性的新方法，實驗操作簡單，具有高精確性和無污染性，為生物制品外來污染尤其是反轉(zhuǎn)錄病毒污染的檢測提供了參考指標(biāo)。

Corresponding Author:KONG Yan, Email: kongy62@yahoo.com.cn www.cmbp.net.cn

作者單位：100050 北京，中國藥品生物制品檢定所

通訊作者：孔艷，Email：kongy62@yahoo.com.cn

收稿日期：2010-09-13

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.008

Development of a real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of reverse transcriptase activity

KONG Yan, WU Xiao-hong, YANG Li-hong, AN Qi, DONG Guan-mu, YU Yong-xin

【Abstract】