王曉靜，梁燕

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌，712100）

花藥和游離小孢子培養(yǎng)是誘導(dǎo)單倍體植物的重要方法之一。把小孢子從花藥中分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，即小孢子培養(yǎng)或游離小孢子培養(yǎng)。與植物花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)排除了花藥壁和絨黏層的影響，便于分析研究[1]。小孢子屬于單倍體，一方面易于誘變；另一方面，無(wú)論是發(fā)生顯性突變還是隱性突變，均可在當(dāng)代表現(xiàn)出來(lái)，易于鑒定和選擇；加之，單倍體植物加倍之后即成為純合二倍體，易于目標(biāo)性狀的固定和遺傳；同時(shí)，小孢子培養(yǎng)還具有周期短、不受氣候條件影響等優(yōu)勢(shì)。就茄果類(lèi)蔬菜目前的研究狀況看，在種質(zhì)材料和研究方法上基本實(shí)現(xiàn)了世界范圍內(nèi)的交流與共享，未被利用的資源日益減少；另外，隨著人們生活水平的提高及生產(chǎn)和研究過(guò)程中各種新問(wèn)題的不斷出現(xiàn)，對(duì)新品種新材料的要求越來(lái)越多樣化，品種的更新速度加快。因此，小孢子培養(yǎng)受到育種家的高度重視。

小孢子培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代初，Nitsch和Norreel首先報(bào)道了煙草的游離小孢子培養(yǎng)[2]，隨后，Kyo和Harada建立了煙草的游離小孢子高效產(chǎn)生單倍體植株的方法[3]。在茄果類(lèi)蔬菜中，番茄小孢子培養(yǎng)開(kāi)展較早，1971年Sharp首次進(jìn)行了番茄小孢子培養(yǎng)[4]，之后對(duì)茄果類(lèi)蔬菜的小孢子培養(yǎng)研究陸續(xù)展開(kāi)，在培養(yǎng)技術(shù)和方法方面做了探索和積累。下面從影響茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)的因子和小孢子培養(yǎng)技術(shù)兩方面進(jìn)行概述。

1 茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)影響因子

1.1 供體植株基因型

基因型是影響游離小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，是小孢子胚胎發(fā)生啟動(dòng)與否的內(nèi)在因素。其影響包括：產(chǎn)生單倍體的途徑、發(fā)生的頻率、形成的時(shí)間、植株的再生能力以及所形成植株單倍體和二倍體的比例等[5]。同一物種的不同亞種乃至品種在誘導(dǎo)率上也表現(xiàn)出極大的差異。Krueger-lebus培養(yǎng)栽培番茄的小孢子發(fā)現(xiàn)有的品種沒(méi)有球形胚出現(xiàn)[6]。袁亦楠等對(duì)夏露地番茄的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，只有薯葉番茄有反應(yīng)[7]。宋彥平等對(duì)茄子小孢子進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，11份供試材料中有7份材料獲得了愈傷組織，且愈傷組織形成的時(shí)期和數(shù)量存在明顯差異，最好的每蕾達(dá)到0.86個(gè)，且所需時(shí)間較短，20 d左右即可形成肉眼可見(jiàn)的愈傷組織[8]。

1.2 供體植株的生理狀態(tài)

供體植株的生理狀態(tài)，包括植株的發(fā)育階段及生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)小孢子培養(yǎng)時(shí)的胚胎發(fā)生具有很大影響。宋彥平等[8]研究發(fā)現(xiàn)，茄子在盛花期（植株主花枝和一級(jí)側(cè)枝的花蕾少量開(kāi)花到一級(jí)側(cè)枝的花蕾已有開(kāi)花之前）采摘的適宜花蕾，胚誘導(dǎo)率最高，始花期誘導(dǎo)率有所下降，末花期更低。小孢子的誘導(dǎo)率還與供體植株的成長(zhǎng)條件有密切的關(guān)系。Nitsch[9]的研究結(jié)果表明，將栽培番茄和細(xì)葉番茄的生長(zhǎng)溫度控制在22℃（晝）/20℃（夜），能將小孢子培養(yǎng)至子葉胚階段。張子君等[10]在對(duì)辣椒小孢子培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在日溫25℃左右、夜溫13℃左右的環(huán)境中生長(zhǎng)的植株，其再生植株誘導(dǎo)頻率最高，日溫超過(guò)30℃時(shí)，誘導(dǎo)頻率下降。另外，對(duì)供體植株施行氮饑餓及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如NAA）處理，可提高煙草小孢子胚的誘導(dǎo)率[11]。有人認(rèn)為這些條件改變了植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)合成或運(yùn)轉(zhuǎn)，使處于發(fā)育中的小孢子由于遭受氮饑餓，偏離了配子體方向而向孢子體方向發(fā)展。

1.3 花粉的發(fā)育時(shí)期

被子植物的花粉發(fā)育歷經(jīng)四分體時(shí)期、單核期（小孢子階段）、雙核期和三核期（雄配子體階段）四個(gè)階段，單核期又可分為單核早期、單核中期、單核晚期[12]。一般所處發(fā)育期越早的花粉，對(duì)培養(yǎng)條件的要求越苛刻，且培養(yǎng)效果不一定好。就多數(shù)植物而言，單核中期至晚期的花粉最容易形成胚狀體或愈傷組織。同樣，對(duì)于茄果類(lèi)作物，最適合小孢子培養(yǎng)的時(shí)期是單核期到雙核期，特別是單核后期。連勇等[13]在茄子小孢子培養(yǎng)的試驗(yàn)中觀察到僅單核期的小孢子有分裂現(xiàn)象，并在隨后的誘導(dǎo)培養(yǎng)中得到大量愈傷組織。另外，由于發(fā)現(xiàn)小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾的長(zhǎng)度有一定的關(guān)系，所以通過(guò)花蕾的長(zhǎng)度來(lái)判斷小孢子發(fā)育時(shí)期是常用的方法，王燁等[14]認(rèn)為，進(jìn)行辣椒小孢子培養(yǎng)時(shí)選擇花蕾的標(biāo)準(zhǔn)是：花蕾的萼瓣等長(zhǎng)或瓣稍長(zhǎng)于萼，并且內(nèi)部花藥尖端微紫。各個(gè)品種的花蕾在這個(gè)發(fā)育階段時(shí)其內(nèi)部的小孢子大部分處于單核期。但是花蕾的大小與供體植株的基因型、生長(zhǎng)條件以及花蕾在植株上所處的位置有關(guān)，因此，要想成功的進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，就必須了解小孢子在特定環(huán)境下的發(fā)育狀況，對(duì)小孢子進(jìn)行鏡檢，將細(xì)胞學(xué)觀察與植物學(xué)相結(jié)合進(jìn)行取材。

2 茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)

2.1 預(yù)處理

在游離小孢子前對(duì)花蕾或花藥進(jìn)行預(yù)處理，有利于提高小孢子胚的誘導(dǎo)率。這主要是從形態(tài)上改變其極性分布，從生理生化上改變其細(xì)胞生理狀態(tài)，從而使小孢子偏離正常的配子體發(fā)育途徑，經(jīng)過(guò)不斷地細(xì)胞分裂，形成胚狀體或愈傷組織，最終成苗[15]。預(yù)處理方式主要包括低溫（通常4℃）、高溫（通常36℃）、甘露醇、秋水仙素、無(wú)碳源、射線(xiàn)等。Duncan等[16]認(rèn)為，低溫可以延緩花粉的退化，使更多花粉有可能開(kāi)始新的細(xì)胞周期。Burgin等[17]用低溫處理煙草花蕾后，小孢子分裂指數(shù)上升。袁亦楠等在番茄游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，供體植株處于低溫環(huán)境下，小孢子類(lèi)胚發(fā)生率提高。Rotino等[18]驗(yàn)證了溫度的高低及處理時(shí)間長(zhǎng)短都對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著影響，高溫處理或低溫和高溫交替進(jìn)行的變溫處理對(duì)茄子愈傷組織的誘導(dǎo)都有一定的效果。Nitsch等用3℃的低溫處理細(xì)葉番茄花蕾48 h，可以明顯提高兩核花粉粒的百分率。王燁等[14]對(duì)5個(gè)不同的辣椒品種進(jìn)行甘露醇預(yù)處理發(fā)現(xiàn)濃度為10 g/L時(shí)，小孢子存活率有所提高。Miyoshi[19]研究結(jié)果表明，饑餓處理對(duì)于茄子雄核發(fā)育的啟動(dòng)有較好的效果。

2.2 培養(yǎng)基

①基本培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的選擇是關(guān)系到成苗與否的一個(gè)重要因素。對(duì)于游離小孢子培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基成分，不同的作物有不同的要求。就目前的研究，用于分離小孢子的分離液主要借鑒于原生質(zhì)體的分離液，培養(yǎng)基主要借鑒同種植物花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)基。辣椒上應(yīng)用的培養(yǎng)基有MS、H、NTH、B5、Nitsch、N6等[20]，其中MS和NTH取得了較好的效果。茄子小孢子培養(yǎng)應(yīng)用的培養(yǎng)基有 KM、MS、NLN、C、R等，其中以KM的效果較好且應(yīng)用廣泛[21]。番茄小孢子培養(yǎng)應(yīng)用到MS、HN、PM以及MH等培養(yǎng)基[22]。

②碳源 糖的種類(lèi)和濃度對(duì)培養(yǎng)基的滲透壓起決定作用。應(yīng)用于小孢子培養(yǎng)的碳源主要包括蔗糖、葡萄糖和麥芽糖。馬欣等[5]對(duì)茄子培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖在3種糖中的效果最好。王燁等[14]對(duì)辣椒小孢子進(jìn)行了3種糖的處理，發(fā)現(xiàn)3%的麥芽糖效果最好。周廣棟等[23]用3%的蔗糖誘導(dǎo)不同品種的番茄，收到一定的效果。在游離小孢子的培養(yǎng)基中加入高濃度的蔗糖對(duì)胚的形成會(huì)產(chǎn)生抑制作用。一般認(rèn)為，茄科植物游離小孢子培養(yǎng)所需的碳源濃度都較低，范圍在2%～4%。

③有機(jī)添加物 在小孢子的發(fā)育過(guò)程中，培養(yǎng)基中的有機(jī)物成分是必不可少的，它們有利于胚胎的發(fā)生。王立浩等[24]研究發(fā)現(xiàn)硝酸銀可以減輕辣椒組織培養(yǎng)中材料的褐化程度，促進(jìn)胚狀體的發(fā)生?；钚蕴考尤肱囵B(yǎng)基，通過(guò)平衡培養(yǎng)基中元素比例進(jìn)而促進(jìn)胚狀體的形成[25]。王玉英等[26]認(rèn)為添加0.5%的活性炭是有益的。王燁等[14]的研究表明，水解酪蛋白、Vb1、谷氨酰胺、活性炭和硝酸銀這4個(gè)因素在小孢子發(fā)生愈傷組織和成胚的過(guò)程中都起著非常重要的作用。在茄子小孢子培養(yǎng)中常用花藥壁與小孢子進(jìn)行短期的共生培養(yǎng)。范適[27]用花藥壁殘?jiān)c茄子游離小孢子共生培養(yǎng)7 d，取得了較好的試驗(yàn)效果。馬欣[28]進(jìn)行了茄子花藥壁和子房與小孢子的共生培養(yǎng)，結(jié)果花藥壁與小孢子共生培養(yǎng)7 d獲得了大量的愈傷組織。

④激素 在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，激素的種類(lèi)及配比是影響誘導(dǎo)頻率的又一個(gè)關(guān)鍵。6-BA、KT、NAA、IAA、2，4-D等不同濃度的配比都曾試用在茄果類(lèi)的小孢子培養(yǎng)中。Matsubara等發(fā)現(xiàn)[29]，在MS培養(yǎng)基上附加KT 0.02 mg/L+2，4-D 0.004 mg/L可誘導(dǎo)胚狀體高頻率發(fā)生，當(dāng)附加2，4-D 0.03 mg/L+KT 0.1 mg/L時(shí)則誘導(dǎo)愈傷組織高頻率發(fā)生。宋彥平等[8]以KM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度激素，研究激素濃度對(duì)茄子愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，最適宜的組合為0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L NAA。然而，袁亦楠在對(duì)番茄的小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在不加激素的培養(yǎng)基上與加了IAA的HN培養(yǎng)基相比，一樣能誘導(dǎo)類(lèi)胚狀體的形成，似乎類(lèi)胚狀體的形成與激素?zé)o關(guān)，但是以往的試驗(yàn)報(bào)道及試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)愈傷組織的形成無(wú)一例外是發(fā)生在含有激素的培養(yǎng)基中。

⑤培養(yǎng)條件 植物離體培養(yǎng)的條件包括溫度、濕度和光照。由于采用液體培養(yǎng)基，容器內(nèi)的相對(duì)濕度幾近100%，所以主要是調(diào)控培養(yǎng)溫度和光照。不少植物的小孢子在較高溫度下培養(yǎng)效果較好，特別是最初幾天經(jīng)歷一段高溫培養(yǎng)出愈率會(huì)明顯提高。對(duì)于茄果類(lèi)蔬菜，在32℃左右培養(yǎng)8～10 d，然后轉(zhuǎn)入25～28℃培養(yǎng)較為適宜。短期的高溫培養(yǎng)不但可以提高出胚率，還有利于愈傷組織的綠苗分化。在培養(yǎng)過(guò)程中前期主要采用黑暗培養(yǎng)，后期進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)光，因?yàn)楹诎涤欣谟鷤M織的生長(zhǎng)，但長(zhǎng)期黑暗會(huì)明顯降低愈傷組織的品質(zhì)和外觀[30]。

3 茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)的現(xiàn)狀與展望

綜上所述，就茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)研究結(jié)果而言， Supena 等[31]、Miyoshi[32]、高秀云等[23]分別獲得了辣椒、茄子、番茄的小孢子再生植株，但數(shù)量極少。目前茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的報(bào)道很少，大多試驗(yàn)停留在愈傷組織或類(lèi)胚狀體階段。存在的主要困難是小孢子會(huì)在游離后迅速大量死亡，小孢子胚誘導(dǎo)頻率低，胚狀體發(fā)育能力差，難以分化形成小植株。

就培養(yǎng)技術(shù)研究而言，由于茄果類(lèi)蔬菜的小孢子培養(yǎng)技術(shù)難度大，發(fā)展非常緩慢，目前大多試驗(yàn)主要研究的是材料的預(yù)處理方式和培養(yǎng)基中添加物的成分及濃度兩方面的內(nèi)容。

茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，針對(duì)目前研究中存在的問(wèn)題，今后應(yīng)該從基礎(chǔ)理論及試驗(yàn)技術(shù)2方面著手，尤其是對(duì)取材時(shí)期、激活處理方法、培養(yǎng)基成分、生長(zhǎng)環(huán)境下小孢子發(fā)育的生理機(jī)制等進(jìn)行更加深入的研究，以期建立一個(gè)系統(tǒng)而又完善的小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。鑒于單倍體育種的顯著優(yōu)勢(shì)，相信茄果類(lèi)蔬菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)將在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，與此同時(shí)，也為茄果類(lèi)蔬菜品種資源的不斷更新提供有力的技術(shù)支持。

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