朱春暉，張德詠，劉勇

（1.中南大學(xué)隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所）

轉(zhuǎn)錄后基因沉默與植物抗病毒研究進(jìn)展

朱春暉1，張德詠2，劉勇2

（1.中南大學(xué)隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所）

主要綜述了轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）的發(fā)現(xiàn)、定義、機(jī)制、與植物抗病毒的關(guān)系及利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默防治植物病毒病研究進(jìn)展。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默；dsRNA；抗病毒

病毒病是農(nóng)作物的主要病害之一，素有植物“癌癥”之稱，難以防治，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每年因植物病毒病所造成的產(chǎn)量損失約占糧食總產(chǎn)量的10%[1]。許多重要病毒已遍及我國農(nóng)作物的主要產(chǎn)區(qū)，對許多作物造成了不同程度的為害，嚴(yán)重影響著這些作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前生產(chǎn)上病毒病防治常用的方法有農(nóng)具、土壤消毒，使用農(nóng)藥驅(qū)除或殺死昆蟲介體，組織脫毒法獲得無病毒繁殖材料及用傳統(tǒng)育種方法引入抗性基因等[2]。這些方法都有不同程度的弊端，例如噴施農(nóng)藥不僅價格高，而且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染；組織脫毒法成本高、工作量大、有效期短；抗病育種存在資源貧乏，抗病基因和劣質(zhì)性狀基因連鎖、周期長、抗性基因遺傳不穩(wěn)定以及不能解決某些品種間的遠(yuǎn)緣雜交等困難。從20世紀(jì)80年代初植物基因工程問世以來，科學(xué)家們就一直探索用基因工程的辦法來改良作物的抗病毒特性。將病毒基因組上基因的cDNA轉(zhuǎn)化到其他植物獲取抗病毒植株是當(dāng)前防治病毒病的重要途徑[3]。即應(yīng)用來源于病原的抗性 （pathogen-derived resistance），現(xiàn)在已經(jīng)有轉(zhuǎn)病毒的CP、MP等基因成功的例子[4]。但使用這種方法獲得高抗轉(zhuǎn)基因植物的幾率較小，因而尋找一種更高效、經(jīng)濟(jì)的獲取抗病毒轉(zhuǎn)基因植株的方法已是當(dāng)務(wù)之急，而植物RNA沉默機(jī)制的揭示為我們提供了新的防治植物病毒病害的前景[3]。

1 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 （post-transcriptional gene silencing，PTGS）的發(fā)現(xiàn)及定義

基因沉默（Gene silencing）[5]是指生物體中特定的基因由于種種原因不表達(dá)，主要發(fā)生在兩種水平上，一種是由于DNA甲基化、異染色質(zhì)化以及位置效應(yīng)等引起的轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默 （transcriptional gene silencing，TGS），另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。PTGS是指轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核里能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的穩(wěn)定的mRNA存在的現(xiàn)象，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過對靶標(biāo)RNA進(jìn)行特異性降解而使基因失活?；虺聊紫仍谵D(zhuǎn)苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）基因的矮牽牛（Petunia）中發(fā)現(xiàn)[6]，后來在其他生物中都有關(guān)于基因沉默的報道。不同領(lǐng)域的研究者給它作了不同的命名：植物學(xué)家稱之為共抑制（co-suppression）或轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）[7～8]；線蟲和果蠅的研究者稱之為RNA干擾（RNAi）[9]；真菌研究者稱之為消除作用（quelling）[10～11]。這些現(xiàn)象其實都是由同源的轉(zhuǎn)基因、RNA病毒和雙鏈RNA等誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特定序列的RNA降解機(jī)制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效地誘導(dǎo)該機(jī)制的起始[12]，隨后它被一種核酶（RNaseⅢ）切割成21~25 nt的小的干擾RNA（siRNA）[13],其中21~23 nt的siRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，共同作為引導(dǎo)物去選擇目標(biāo)RNA并對它進(jìn)行降解。植物中RNA沉默的最顯著特征是它是一種非細(xì)胞自發(fā)的過程，能夠局部誘導(dǎo)，隨后通過一種可移動的信號分子擴(kuò)散至整個植物組織[9,14]。其作用表現(xiàn)在抵御病毒、轉(zhuǎn)座子等外來核酸的入侵、識別并抑制外源基因的表達(dá)，具有維持生物基因組穩(wěn)定性的重要功能[15]。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是由植物病毒載體感染植物引起的并啟動相應(yīng)的寄主中RNA沉默的現(xiàn)象[16]。病毒誘導(dǎo)基因沉默能有效地抑制與內(nèi)源基因相關(guān)的一些生物合成途徑。病毒誘導(dǎo)基因沉默不僅是研究基因沉默機(jī)制的熱點，而且還是研究植物抗病防御和植物基因功能的一種有效手段。病毒誘導(dǎo)基因沉默是由RNA介導(dǎo)植物抗病防衛(wèi)機(jī)制（RNA-Mediated Defense，RMD）和一個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（PTGS）引起的。已經(jīng)證明，病毒誘導(dǎo)基因沉默是植物抗病的可能機(jī)制[17]。

2 PTGS的機(jī)制

PTGS是一個很復(fù)雜的過程，目前其機(jī)制還沒有統(tǒng)一[18]。從PTGS應(yīng)用的不同系統(tǒng)和不同的角度研究，人們先后提出了一系列的假說[19]。但其過程主要分為3步：起始、維持和傳導(dǎo)。目前對PTGS的誘發(fā)機(jī)制的解釋有3種模型，即RNA閾值模型、異常RNA模型、雙鏈RNA模型[20]。在這一系列模型中RNA起著非常重要的作用，它不僅是PTGS現(xiàn)象的啟動因子，同時也是PTGS作用的靶分子[21]。不論何種誘發(fā)因素，所導(dǎo)致的RNA沉默最后都匯集到dsRNA產(chǎn)生后對同源性較高的目標(biāo)基因的mRNA降解這一過程上。

2.1 RNA閾值模型（RNA threshold model）

該模型認(rèn)為，由于激發(fā)了外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄，以至于積累到某個閾值，從而啟動了降解特定mRNA的反應(yīng)，造成轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默[22]。

2.2 異常RNA模型（aberrant RNA model）

這一模型認(rèn)為轉(zhuǎn)基因mRNA的異常結(jié)構(gòu)激活了PTGS。Dougherty等[23]認(rèn)為在植物的細(xì)胞質(zhì)中存在一種依賴于RNA的RNA合成酶（RdRp），能以mRNA為模板合成小片段的cRNA，cRNA與mRNA雜交，從而成為專一性作用于雙鏈RNA的RNA降解酶的底物，提出了RdRp-cRNA模型。已從番茄中發(fā)現(xiàn)了RdRp，體外試驗證明該酶能以RNA為模板合成cRNA[24]，在體內(nèi)這些cRNA雜合到相應(yīng)的mRNA上，被特異作用于雙鏈RNA的RNA降解酶降解。

2.3 雙鏈RNA模型

前面敘述的2種模型都著重于PTGS的起始，而隨著對參與PTGS的細(xì)胞成分及相關(guān)基因的深入研究，人們對PTGS作用機(jī)制有了更為詳盡的了解，現(xiàn)在普遍認(rèn)可的機(jī)制是在上述2種模型的基礎(chǔ)上由Waterhouse等[25]提出的dsRNA模型 。

①dsRNA對RNA沉默機(jī)制的啟動 隨著PTGS的發(fā)現(xiàn)，許多理論都試圖去解釋RNA沉默的機(jī)制以及該機(jī)制的誘導(dǎo)因素[26～27]?，F(xiàn)在普遍接受的觀點是dsRNA是RNA沉默的有效誘導(dǎo)因子，該機(jī)制通過降解特定序列的RNA發(fā)揮作用。通過使用以RNA病毒和轉(zhuǎn)基因為目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，該機(jī)制首次在植物中得到了證實。Waterhouse等[28]發(fā)現(xiàn)單獨表達(dá)正義或反義的馬鈴薯Y病毒（PVY）蛋白酶（Pro）基因的轉(zhuǎn)基因煙草對PVY沒有抗性，但是同時表達(dá)正義和反義的PVY Pro基因的雜交煙草植株則對其產(chǎn)生免疫；與此相類似的是表達(dá)自我互補(bǔ)（hairpin）的GUS轉(zhuǎn)基因在沉默GUS基因方面，其效率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨轉(zhuǎn)正義或反義的GUS轉(zhuǎn)基因；煙草中79 nt的反向重復(fù)ACC氧化酶序列可以有效地抑制ACC氧化酶的表達(dá)[29]。這一結(jié)果進(jìn)一步證明，dsRNA是基因沉默的有效的誘導(dǎo)因子。在矮牽牛中也存在著CHS基因的沉默和相同基因的兩個或更多個轉(zhuǎn)基因拷貝的反向重復(fù)插入的聯(lián)系[30]。這種轉(zhuǎn)基因的插入方式可以通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA[31]。不同情況下啟動RNA沉默的dsRNA來源不同，轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的RNA沉默其dsRNA可以由轉(zhuǎn)基因的反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，也可以將目標(biāo)基因的正義鏈和反義鏈同時轉(zhuǎn)入植物中雜交產(chǎn)生[28]，還可以通過RdRp將轉(zhuǎn)基因的異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)變而成[32～33]；RNA病毒誘導(dǎo)的RNA沉默的dsRNA幾乎都來源于病毒復(fù)制的中間體[34]，少數(shù)像黃瓜花葉病毒（CMV），馬鈴薯X病毒（PVX）等病毒，它們復(fù)制中的dsRNA可以來自該病毒產(chǎn)生的異常RNA[35]；RNAi中的dsRNA則是來源于體外注射dsRNA等[9]。dsRNA在由單拷貝轉(zhuǎn)基因所引起的RNA沉默中的作用還未知，但是很可能某些轉(zhuǎn)基因，如CHS基因和Nii基因，當(dāng)它們的RNA足夠多時，在它們的編碼區(qū)含有能誘導(dǎo)沉默的dsRNA結(jié)構(gòu)[34]，另一種可能性是植物編碼的RdRp，把單鏈RNA作為模板去合成能誘導(dǎo)沉默的dsRNA[32～33]。至于DNA病毒，確實很難想象它的dsRNA是如何產(chǎn)生的。不過在它的基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時確實偶爾有dsRNA生成，現(xiàn)在人們推測DNA病毒誘導(dǎo)RNA沉默的原因有3種情況：一種是DNA病毒的復(fù)制能力和高轉(zhuǎn)錄水平能夠?qū)е耫sRNA分子的積累；另一種是dsRNA分子中以ssRNA為模板，通過寄主的RdRp合成的；第三種可能性就是在DNA病毒侵染的細(xì)胞中，誘導(dǎo)RNA沉默的因子本身就不是dsRNA分子。又有研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA在植物中能誘導(dǎo)特定序列的DNA甲基化[36～37]，從而促進(jìn)異常RNA產(chǎn)生，進(jìn)一步來強(qiáng)化PTGS。

②dsRNA降解成21~23 nt RNA Hamilton等[38]和Elbashir等[33]發(fā)現(xiàn)，有等量的正義鏈和反義鏈21~23 nt RNA存在于發(fā)生RNA沉默的植物和動物中。這暗示著，誘導(dǎo)RNA沉默的dsRNA很可能是這些小分子的前體物質(zhì)。后來，Bernstein等[39]從果蠅（Drosophila）中分離到了一個RNase III的蛋白酶-Dicer，它能夠在體外把dsRNA降解成21~23 nt RNA[40]，21~23 nt RNA能夠特異性地攻擊目標(biāo)RNA。Dicer的缺失突變會減弱果蠅引發(fā)RNAi的能力，說明Dicer是催化切割dsRNA形成小分子RNA的一個關(guān)鍵酶，而Dicer的發(fā)現(xiàn)有力地支持了dsRNA確實是在Dicer的催化下降解成小分子RNA。

③21~23 nt RNA是RNA沉默的特異性決定因子在轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生RNA沉默時，發(fā)現(xiàn)有一種低分子量的反義RNA的持續(xù)積累，這種RNA與目標(biāo)mRNA序列具有高度同源性[38]。類似大小的RNA分子也在動物執(zhí)行RNAi中檢測到[41～42]，它們是與一種核酸酶一起被分離的，并且這種核酸酶是一種由多個亞基組成的復(fù)合體，即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）[13]，低分子量的RNA是和RISC結(jié)合在一起的，它首先在果蠅S2細(xì)胞中被分離到。最近的研究表明，在果蠅中，21~23 nt RNA分子對于RISC誘導(dǎo)的同源、單鏈RNA分子的降解是必要的，并且也足夠誘導(dǎo)其發(fā)生降解[43]。低分子量的RNA在RISC復(fù)合物中能夠特異性地識別ss-RNA序列。這些都表明21~23 nt RNA可能是RNA沉默的特異性決定因子。

3 PTGS是植物自然的抗病毒機(jī)制

PTGS是植物在長期進(jìn)化的過程中形成的一種抵御外來病毒的防衛(wèi)機(jī)制。因為：①在轉(zhuǎn)病毒基因的轉(zhuǎn)基因植物中，病毒是RNA沉默降解的靶標(biāo)；②在轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)，病毒能誘導(dǎo)RNA沉默；③交叉保護(hù)試驗中由于誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生的RNA沉默，而使植物對含有與之高度同源核酸序列的相近病毒的侵染具有抗病功能；④病毒表達(dá)特異的蛋白能抑制RNA沉默；⑤沉默信號的存在，也意味著RNA沉默是植物的抗病機(jī)制。在侵染細(xì)胞中產(chǎn)生的RNA沉默向侵染部位的前方傳導(dǎo)，因此，非侵染細(xì)胞接受信號后能激活自身的抗病反應(yīng)，使植物系統(tǒng)抗病。證明病毒誘導(dǎo)基因沉默與植物抗病有關(guān)的 3個經(jīng)典試驗：①RNA病毒介導(dǎo) RMD （RNA Mediated Defence，RMD）。Ratcliff等人[45]利用線蟲傳花葉病毒屬中的番茄黑環(huán)病毒接種煙草（Nicotianasp.），該病毒攜帶與寄主植物基因序列相似的一段片段，可以誘導(dǎo)煙草后期出現(xiàn)同源依賴的抗病毒抗性。結(jié)果表明，抑制或預(yù)防病毒感染的植物體內(nèi)抗性機(jī)制是存在的[46]。②DNA病毒介導(dǎo)RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Al-Kaff等[47]人用花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）分別接種含有設(shè)計成與CaMV的DNA序列同源、部分同源或完全不同源3種的轉(zhuǎn)基因油菜，結(jié)果與病毒同源的轉(zhuǎn)基因在CaMV感染下被沉默。③基因沉默信號介導(dǎo)RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Hamilton等[48]人將帶有水母綠色熒光蛋白（Jellyfish Greenfluorescent Protein，GFP）的轉(zhuǎn)基因煙草 （Nicotiana benthamiana）浸泡在帶有GFP報告基因的農(nóng)桿菌菌液里，結(jié)果表明GFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是沉默的。進(jìn)一步試驗證明，GFP轉(zhuǎn)基因沉默與GFP信使RNA水平降低有關(guān)。沉默是一種信號分子產(chǎn)生的，而且核酸是通過病毒或類病毒移動的渠道在植物中移動，阻止病毒擴(kuò)散。Bosher等[49]研究反義RNA是基因沉默的信號，因為只要有足夠的宿主編碼的RNA指導(dǎo)下的RNA聚合酶的底物，反義RNA（antisense RNA，asRNA）就能被合成，如果相關(guān)mRNA的3＇端特定部分降解，就會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。

4 利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）防治植物病毒病研究進(jìn)展

自從1986年Beachy等將TMV的外殼蛋白（CP）基因?qū)霟煵?，在世界上首次獲得了抗TMV感染的轉(zhuǎn)基因植株，隨后證明不但植物病毒的CP基因可在多種植物上產(chǎn)生不同程度的保護(hù)作用，病毒基因組上的其他基因，如復(fù)制酶（Rep）基因，移動蛋白（MP）基因等轉(zhuǎn)化植物后也具有一定的抗性。目前，人們已將多種病毒來源的基因轉(zhuǎn)入多種植物獲得了多種抗病毒植株，有的已經(jīng)進(jìn)入了商品化生產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了一定的經(jīng)濟(jì)效益及社會效益。然而，人們基本上還是將病毒基因組上某一基因的一段或全部基因的cDNA構(gòu)建成正義或反義結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入植物，所得抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的比例和抗性程度都不高。PTGS現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為植物病毒病的防治提供了新的可能。PTGS是真核生物細(xì)胞對外源遺傳因子的一種特異性的、高效率的降解機(jī)制，這種機(jī)制一旦被外源RNA分子所激活就能通過序列同源性的行為對任何胞質(zhì)RNA進(jìn)行降解[50]。自從首次在轉(zhuǎn)基因矮牽牛中發(fā)現(xiàn)RNA沉默現(xiàn)象以來，已發(fā)現(xiàn)RNA沉默是生物界中普遍存在的現(xiàn)象，是與植物的抗病性密切相關(guān)的過程[51]。RNA沉默的最突出的特征是它可以局部誘導(dǎo)，并通過韌皮部系統(tǒng)[52～53]傳播。盡管具體的沉默信號分子還未鑒定。但RNA降解過程的序列特定性表明，它很可能是一種核酸分子[35]。1998年Schiebel等[54]將PVY的Pro基因分別正向或反向轉(zhuǎn)入煙草中，再對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)雜交后代含有正向或反向Pro基因的轉(zhuǎn)基因煙草中，有約15%的植物對PVY產(chǎn)生抗性或免疫，而同時含有正向和反向Pro蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草，對PVY有免疫作用的植株就占轉(zhuǎn)基因植株總數(shù)的44%~54%。他們推斷很可能在同一植物細(xì)胞中同時含有正義和反義RNA（即dsRNA）是誘導(dǎo)煙草植株對PVY免疫的真正原因。這是在植物界中，最早發(fā)現(xiàn)病毒抗性能同時被表達(dá)正義和反義RNA誘導(dǎo)。這一發(fā)現(xiàn)把研究基因功能、沉默植物的內(nèi)源基因以及抗病策略引向依靠同源的dsRNA誘導(dǎo)RNA沉默這一機(jī)制上。

隨著研究的深入，已有研究發(fā)現(xiàn)植物中的RNA沉默能被編碼dsRNA或自我互補(bǔ)的發(fā)夾RNA（hairpin RNA，hpRNA）所誘導(dǎo)[12，25，55]。人為設(shè)計這種類型的遺傳結(jié)構(gòu)，如將目標(biāo)基因的一段或全部cDNA設(shè)計成含有自我互補(bǔ)RNA的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)入植物以后能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生hpRNA，啟動植物體內(nèi)的RNA沉默，從而降解hpRNA的雙鏈區(qū)和與雙鏈同源的內(nèi)源的mRNA。利用dsRNA能誘導(dǎo)RNA沉默從而導(dǎo)致與dsRNA同源的內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制已經(jīng)有幾例報道。2002年Stoutjesdijk等[56]報道了將擬南芥內(nèi)源的Delta脫氫酶基因（FAD2）構(gòu)建成hpRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥菜。發(fā)現(xiàn)大約有75%的轉(zhuǎn)hpRNA結(jié)構(gòu)的植物，Delta脫氫酶的活性急劇下降。Liu等也通過了hpRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)產(chǎn)生了富含硬脂肪酸和油酸的棉籽油。而在利用dsRNA技術(shù)進(jìn)行植物的抗病毒方面卻很少有報道。

2000 年Wang等[12]將大麥黃矮病毒-PAV（BYDVPAV）的聚合酶基因（Polymerase）構(gòu)建成hp BYDV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化大麥，有36%的轉(zhuǎn)基因植株對BYDV-PAV具有免疫作用。2003年浙江大學(xué)的牛顏冰博士[57]以黃瓜花葉病毒（CMV）的Fny分離物的復(fù)制酶基因（△Rep）構(gòu)建成具有反向重復(fù)序列的pBluescript SK-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，有25/40的植株獲得對CMV的抗性；以番茄花葉病毒（ToMV）運(yùn)動蛋白基因（MP）構(gòu)建成具有反向重復(fù)序列的pBluescript SK-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，有23/47的植株獲得了對TMV的抗性。而且研究發(fā)現(xiàn)瞬時表達(dá)或摩擦接種的dsRNA都能啟動RNA沉默的起始，但保持則需要與目標(biāo)RNA同源的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源基因。2003年Anastasia[58]等用來源于PVY的CP基因構(gòu)建了能夠表達(dá)dsRNA的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化馬鈴薯，有12/15的轉(zhuǎn)基因的植株能夠產(chǎn)生抗性，而且對PVY的三個株系均有高度抗性。

從2003年開始，西班牙的Tenllado在這方面做了比較多的系統(tǒng)的研究。首先他及他的同事把辣椒輕度斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）的54 kDa蛋白區(qū)域、煙草蝕紋病毒（TEV）的HC-Pro蛋白、及苜蓿花葉病毒（AMV）的各個RNA的cDNA克隆體體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA，將得到的dsRNA與同源病毒摩擦接種植物葉片，發(fā)現(xiàn)只有與該病毒具有極高序列同源性的dsRNA才能對侵染產(chǎn)生干擾作用。其抗病性分析還表明，產(chǎn)生干擾侵染作用對dsRNA的長度、濃度都有要求，而且植物中局部導(dǎo)入dsRNA不能誘發(fā)系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)[59]。隨后他們首次證實用含有能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA的結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌浸潤接種非轉(zhuǎn)基因植物葉片，所得dsRNA對植物病毒浸染具有干涉作用。并進(jìn)一步證明dsRNA對目的病毒有特異抗性，證實了誘導(dǎo)沉默的都是RNaseIII切割dsRNA的siRNAs[60]。他們還利用缺失RNAase III的大腸桿菌HT115（DE3）菌株[61]初步建立了dsRNA的細(xì)菌生產(chǎn)體系和粗提取方法，研究了dsRNA粗提取物處理植物的噴灑技術(shù)，為促使細(xì)菌生產(chǎn)dsRNA抗病毒技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用作了一些預(yù)期工作[62]。

2006 年Zhao等[63]人根據(jù)TMV 126 kDa蛋白基因設(shè)計合成shRNA（short hairpin RNA），能有效的干擾TMV的侵染，此干擾是序列特異的，受時間和位點影響，而且必須是shRNA與TMV接種在同一葉片上，此結(jié)果開啟對植物病毒在RNAi方面治療性的新進(jìn)展。

2008 年，張德詠等[64]構(gòu)建了含有CMV同源基因的RNA2片段和MP基因反向重復(fù)片段的原核表達(dá)載體。利用大腸桿菌HT115（DE3）菌株中可表達(dá)產(chǎn)生目的dsRNA。用能夠表達(dá)dsRNA的細(xì)菌超聲波破碎后在溫室中處理煙草進(jìn)行保護(hù)和治療試驗，結(jié)果表明，兩種表達(dá)dsRNA的細(xì)菌破碎液能夠誘導(dǎo)煙草對CMV產(chǎn)生抗性，保護(hù)效果試驗60 d后發(fā)病率分別為45%和60%，治療效果試驗60 d后發(fā)病率分別為75%和85%，而其他對照發(fā)病率均為100%。此結(jié)果為dsRNA的田間應(yīng)用提供了研究參考。

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Progress on Post-transcriptional Gene Silencing and Anti-virus of Plant

ZHU Chunhui1,ZHANG Deyong2,LIU Yong2
(1.Department of Longping,Zhongnan University,Changsha 410125;2.Hunan Institute of Plant Protection)

The discovery,definition,mechanism,the relation with plant anti-virus of post-transcriptional gene silencing (PTGS),and controlling plant virus through PTGS are summarized.

Post-transcriptional gene silencing;Double-stranded RNA;Anti-virus

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.08.001

朱春暉（1980-），女，在職博士，助理研究員，研究方向是植物病毒分子生物學(xué)，電話：0731-84411303，13782032139。E-mail：zhuchunhuizhb@yahoo.com.cn

2009-10-09