袁湘杰，王曉非，王麗紅*

（吉林大學(xué)白求恩制藥廠，吉林 長(zhǎng)春 130021）

凝血酶工藝優(yōu)化和穩(wěn)定性的研究

袁湘杰，王曉非，王麗紅*

（吉林大學(xué)白求恩制藥廠，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目的進(jìn)行凝血酶工藝優(yōu)化和穩(wěn)定性的研究。方法選用Ca2＋和凝血活酶聯(lián)合激活系統(tǒng)激活、DEAESephadex A-50吸附法等技術(shù)提取出粗凝血酶，采用離子交換層析法，從粗凝血酶中純化得到凝血酶純品，對(duì)兩者純化效果進(jìn)行比較。結(jié)果優(yōu)化后的工藝比原生產(chǎn)工藝有明顯提高。結(jié)論優(yōu)化工藝應(yīng)把生產(chǎn)凝血酶時(shí)溫度控制在25℃，pH＝7，從豬血漿的吸附到凝血酶半成品，應(yīng)在4 h內(nèi)完成，這樣才能獲得較高純度的凝血酶。

凝血酶；豬血漿；工藝；優(yōu)化

血漿中凝血酶是近年來開發(fā)的一種新型止血?jiǎng)?。生產(chǎn)工藝多以新鮮豬血為原料，采用離心、Ca2＋單一因子激活系統(tǒng)激活、等電點(diǎn)沉淀法或724樹脂吸附法等技術(shù)提取出粗凝血酶，采用親和層析法，從粗凝血酶中純化得到凝血酶純品。但這種生產(chǎn)工藝提取收率低，工藝復(fù)雜，產(chǎn)品純度不高等。故有必要進(jìn)行凝血酶工藝優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 豬血漿的制備 取新鮮豬血加入3.8%的檸檬酸鈉作為抗凝劑，在7 000 r／min下4℃離心20 min，收集上清液，即得豬血漿，備用。凝血酶原的制備：比較3條制備路線。等電點(diǎn)沉淀法：豬血漿0.5 kg，以9倍的去離子水稀釋，用2 mol／L醋酸調(diào)pH 5.1，4℃靜止過夜，收集沉淀，該沉淀用緩沖液溶解，去除沉淀，即獲得凝血酶原粗樣品液。724樹脂吸附法：豬血漿0.5 kg，將處理好的724樹脂適量加入，攪拌45 min，靜止30 min。抽濾得到吸附劑，然后用1.5 mol的氯化鈉溶液300 mL常溫浸泡60 min，收集濾液。再用200 mL常溫浸泡40 min，合并濾液。得到凝血酶原。DEAE-Sephadex A-50 吸附法：豬血漿 0.5 kg，將處理好的DEAE-Sephadex A-50適量加入，攪拌45 min，靜止30 min。抽濾收集吸附劑，然后用1.5 mol的氯化鈉溶液300 mL常溫浸泡60 min，收集濾液。再用200 mL常溫浸泡40 min，合并濾液。得到凝血酶原。

1.2 凝血酶原活力檢測(cè) （1）凝血酶原激活：取中性凝血酶原液1 mL，加入 0.25 mol／L的 CaCl2溶液，使Ca2＋濃度達(dá)到 0.05 mol／L，常溫放置 1 h。得待測(cè)凝血酶原粗樣品液。（2）纖維蛋白原溶液的制備：取纖維蛋白原約30 mg，精密稱定，用0.9%氯化鈉溶液1.5 mL溶解加凝血酶0.1 mL（約3單位），快速搖勻，室溫放置約1 h至完全凝固，取出凝固物，用水洗至洗出液加硝酸銀試液不產(chǎn)生渾濁，在105℃干燥3 h，稱取重量，計(jì)算纖維蛋白原中含凝固物的含量（%）。然后用0.9%氯化鈉溶液制成含0.2%凝固物的纖維蛋白原溶液，用 0.05 mol／L磷酸氫二鈉溶液或0.05 mol／L磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.0 ～ 7.4，再用0.9%氯化鈉溶液分別制成含0.1%凝固物的溶液，備用。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品，用0.9%的氯化鈉溶液分別制成每毫升含 5.0，6.4，8.0，10.0 u的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取內(nèi)徑1 cm，長(zhǎng)10 cm的試管4支，各精密加入纖維蛋白原溶液0.9 mL，置（37±0.5）℃水浴中保溫5 min，再分別精密量取上述4種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1 mL，迅速加入上述各試管中，立即計(jì)時(shí)，搖勻，置（37±0.5）℃水浴中，觀察纖維蛋白的初凝時(shí)間，每種濃度測(cè)5次，平均值（5次測(cè)定之最大值與最小值的差不得超過平均值的10%，否則重測(cè)）。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度應(yīng)控制凝結(jié)時(shí)間在14～60 s為宜。在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以每管中標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際效價(jià)（u）為橫坐標(biāo)，凝結(jié)時(shí)間（s）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）酶活測(cè)定：取待測(cè)凝血酶樣品液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的方法求出凝結(jié)時(shí)間平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得酶活單位數(shù)。通過對(duì)3條凝血酶原制備工藝得到的凝血酶原的活力測(cè)定來選擇最佳的方案。

1.3 凝血酶原的激活 兩套激活系統(tǒng)。以 Ca2＋單一因子激活系統(tǒng)激活凝血酶原實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 Ca2＋濃度對(duì)凝血酶活力的影響 取豬凝血酶原樣品液分成 6份，加入 0.2 mol／L的 CaCl2溶液，使Ca2＋分別達(dá)到 0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，1.0 mol／L 的終濃度，并在室溫下放置1 h，分別測(cè)定凝血酶活力。

1.3.2 Ca2＋激活時(shí)間對(duì)凝血酶活力的影響 將含有0.05 mol／L Ca2＋的豬凝血酶樣品液在室溫下放置，依次在 0.5，1，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 h 取測(cè)定凝血酶活力。Ca2＋和兔腦粉聯(lián)合激活系統(tǒng)激活凝血酶原實(shí)驗(yàn)：取中性凝血酶原樣品液兩份，一份加入預(yù)處理好的兔腦粉溶液和IMCaCl2溶液在37℃水浴中保溫 30 min。得到凝血酶樣品溶液；一份按 2.2.3.1項(xiàng)下得到的最佳激活參數(shù)進(jìn)行激活得到凝血酶樣品溶液。測(cè)定兩溶液的活力。

1.4 凝血酶純化方法研究 兩種方法。

1.4.1 離子交換層析法 將凝血酶樣品溶液上樣到事先用 0.05 mol／L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE離了交換纖維素柱。經(jīng)同樣的緩沖液充分淋洗后，改用1 mol／L的氯化鈉溶液洗脫，分部收集活性部分，為凝血酶純品。

1.4.2 親和層析法 將凝血酶樣品溶液上樣到事先用 0.05 mol／L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液平衡好的 HeparinSepharose 4B親和層析柱（親和層析柱制法見文獻(xiàn)［1］）。經(jīng)同樣的緩沖液充分淋洗后，改用2 mol／L的氯化鈉溶液洗脫，分部收集活性部分，為凝血酶純品。

1.5 凝血酶穩(wěn)定性的研究

1.5.1 熱穩(wěn)定性 將豬凝血酶溶液分別置于不同溫度下，保溫不同的時(shí)間，分別測(cè)定凝血酶的活力。根據(jù)文獻(xiàn)［2］記載，凝血酶溫度從0℃增加到40℃，活性變化不大，在40℃保溫7 h，活力無明顯下降，而保溫27 h，活力下降84%。

1.5.2 pH對(duì)凝血酶活性的影響 分別取0.5 mL酶液，加入5 mL不同pH緩沖液當(dāng)中，充分搖勻，然后測(cè)定各個(gè)pH中的酶活力。

1.5.3 溫度對(duì)凝血酶活性的影響 將底物血漿和酶置于不同溫度下保溫5 min，然后測(cè)定酶活力。

1.5.4 凝血酶的貯藏穩(wěn)定性 將酶溶液保存在－20℃冰箱中，每隔一定時(shí)間測(cè)定酶活力。

1.5.5 鹽離子濃度對(duì)凝血酶穩(wěn)定性的影響 取酶液0.5 mL，加入不同量的含 4 mol／L NaCl的 0.05 mol／L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液，使 NaCl濃度為 0.15，0.30，0.45，0.60，1.00，2.00 mol／L，用 0.05 mol／L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足體積為5 mL，室溫放置3 h，測(cè)定各個(gè)濃度下的酶活力。

1.6 凝血酶穩(wěn)定劑的研究 取具塞試管12支，對(duì)照組3支，實(shí)驗(yàn)組9支。對(duì)照組：每支含1 000 u凝血酶的溶液50 mL。實(shí)驗(yàn)組：配制含甘氨酸0.15%和明膠0.10%的凝血酶溶液50 mL，酶活力1 000 u，分裝入9支試管中，5 mL／支。

將上述試管在60℃下存放7 d，14 d，1月和2月，測(cè)定凝血酶活力，進(jìn)行比較。

通過對(duì)不同pH的凝血酶純品的凝血酶活力測(cè)定的數(shù)據(jù)，可以看出當(dāng)pH＝7時(shí)，酶活力最穩(wěn)定，而大于或小于7時(shí)，酶活力明顯下降。

2 結(jié)果

凝血酶最佳制備工藝的確立：以新鮮的豬血漿為原料，經(jīng)兩次DEAE-Sephadex A-50吸附法吸附，然后用Ca2＋和凝血活酶聯(lián)合激活系統(tǒng)進(jìn)行激活，再通過離子交換層析法進(jìn)行純化，所得凝血酶半成品用LGJ 0.5冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，經(jīng)8 h凍干后即得凝血酶成品。

3 結(jié)論

生產(chǎn)凝血酶時(shí)溫度要控制在25℃，用0.05 mol／L磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH＝7，從豬血漿的吸附到凝血酶半成品，應(yīng)在4 h內(nèi)完成，這樣才能獲得較高純度的凝血酶。

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005（1）：1056-1057.

［2］陸茂林.凝血酶制備工藝的研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2002（3）：151-152.

［3］史進(jìn)元.凝血酶穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，1999（6）：296-297.

R283.6

A

1007－4813（2010）06－0961－02

2010－ 10－09）