趙宇輝,黃 亮,孫忠人

(1.深圳市寶安區(qū)觀瀾醫(yī)院,廣東深圳 518110;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150001;3.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江哈爾濱 150040)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元嚴重缺失為主要病變,廣泛累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的較為常見且癥候復雜多樣的慢性神經(jīng)元變性性疾病。目前其發(fā)病機制尚未明確,但內(nèi)、外源性神經(jīng)毒素可能起到重要作用。治療方面,針灸治療PD的有效性已為臨床及實驗研究所證實[1,2],尤其是電針或頭針較多學者研究并證明有效[3～7]。針刺治療震顫麻痹是一種行之有效的方法,近年來關于針刺治療 PD的機理,比較集中于紋狀體、尾核、中腦、蒼白球系等腦區(qū),實驗室研究多關注于多巴胺(DA)的含量變化,臨床指標多以肌電圖和腦部電生理改變?yōu)橹?。但前者多處在動物試驗階段,其他指標少見,細胞凋亡幾乎沒有。由于對其獲效機制的研究較少,尤其在電針舞蹈震顫區(qū)治療方面,基礎研究幾乎沒有。筆者通過臨床上大量病例證明其安全有效,故本研究通過對實驗性 PD大鼠的電針治療,進一步完善其客觀性、可比性、可靠性,觀察電針對 PD模型大鼠行為學及黑質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡的影響,對治療 PD的機制進行進一步探討。

1 實驗材料

SD大鼠,健康雄性,體重 230～250 g,清潔級(由黑龍江中醫(yī)藥大學動物中心提供)。6-羥基多巴胺(6-OHDA),HBr,購自美國 Sigma chemical Co公司。阿樸嗎啡 Apomorphine.HCl,APO,購自美國 Sigma chemical Co公司。TUNEL細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma chemical Co公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

60只大鼠隨機分成 5組,正常組、假手術(shù)組、模型組、電針組、藥物組。每組 12只。

2.1.1 正常對照組 常規(guī)飼養(yǎng)。常溫常濕,自由飲水。

2.1.2 假手術(shù)組 進行建立實驗模型手術(shù),不注入 6-OHDA。手術(shù)后不作其他處理。

2.1.3 模型組 建立實驗模型后不作其他處理。

2.1.4 電針組 造模后給予電針治療。造模后,取右側(cè)舞蹈震顫區(qū)(位于運動區(qū)前 1.5 cm的平行線即是)上點與下點用 0.25 mm×25 mm毫針針刺,連接 KWD-808Ⅱ型全能脈沖電療儀,疏密波,頻率 1 Hz,電壓0.1 V,強度以大鼠擺尾為度,每日 1次,時間 30 min,共治療 20天。

2.1.5 左旋多巴藥物組 造模后給予 400 mg/kg的劑量左旋多巴灌胃治療,每日 1次,共治療 20天。

2.2 實驗模型的建立

手術(shù)前準備,成熟健康 SD大鼠,雄性,體重 230～250 g。動物在室溫下籠中常規(guī)喂養(yǎng),術(shù)前不禁食。6-羥基多巴胺溶于 0.02%的抗壞血酸液中配制成0.2%的溶液,-20℃冰箱密封避光保存?zhèn)溆?。阿樸嗎啡用雙蒸水配成 0.01%溶液備用,以上溶液要求嚴格無菌。

選擇性右側(cè)偏側(cè)大鼠 PD模型[8,9],制備動物用0.3%戊巴比妥鈉 10 ml/kg腹腔注射麻醉后,固定在立體定位儀上。在無菌條件下,正中切開大鼠顱頂部皮膚,剝離骨膜,暴露前囟、人字縫。用鼠顱骨鉆于手術(shù)要求部位鉆直徑為 5 mm的顱骨孔。參照 Pellegrino等[10～12]。大鼠腦立體定位圖譜,參看 Whishaw等體重在 180～250 g范圍內(nèi)的大鼠使用此圖譜的數(shù)學折算方法。確定右側(cè)黑質(zhì)部位坐標位置。用微量進樣器分兩次將 6-OHDA按下列坐標位置注入右側(cè)黑質(zhì)部建立右側(cè)選擇性大鼠 PD模型。B坐標系統(tǒng)：外耳道連線低于上門齒板上緣 5 mm,即水平 0平面。第 1次注射 4μl,針尖斜面朝嘴側(cè),坐標為前囟后 3.0 mm,正中線右側(cè) 2.5 mm,硬腦膜腹側(cè) 8.6 mm。第 2次注射 3 μl,針尖斜面朝尾側(cè),坐標為前囟后 2.4 mm,正中線右側(cè) 2.7 mm,硬腦膜腹側(cè) 8.6 mm。注射速度為 1μl/min,每次注射完畢留針 10 min,然后以 1.0 mm/min速度緩慢拔針。手術(shù)完畢,用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合切口,放回籠中喂養(yǎng)。

APO誘發(fā)動物旋轉(zhuǎn)行為觀察：造模術(shù)后 2周,大鼠腹腔注射 0.01%,APO 10 ml/kg誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為,驗證 6-OHDA對中腦黑質(zhì) DA神經(jīng)元的損傷效應。注射 APO 10 min開始記錄,共記錄 30 min。旋轉(zhuǎn)速度達到 6 r/min視為選擇性偏側(cè)大鼠 PD模型制備成功。

3 觀察指標測定、統(tǒng)計分析

行為學檢測：分別于治療前及治療后對各組大鼠進行 APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為測試,比較治療前后行為學的改變。

測定組織中的細胞凋亡：原位末端標記法(TUNEL法)檢測細胞凋亡。切片滴加蛋白酶 K,消化5 min,TBS漂洗,滴加末端標記酶置溫盒內(nèi) 37℃水浴2 h,TBS漂洗封閉液室溫孵育 30 min,TBS漂洗,DAB顯色,顯微鏡觀察。細胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL染色陽性的凋亡細胞。

美國計算機圖象分析處理系統(tǒng)上,測定陽性細胞數(shù)目的平均光密度(IOD/area)。采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件做分析,結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較用單因素方差分析,q檢驗。P＜0.05時判定差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 行為學檢測

治療前模型組、電針組、藥物組之間 PD大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)無顯著性差異,治療后電針組、藥物組 PD大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯少于模型組(P＜0.01)。其中電針組和藥物組無明顯差異(P＞0.05)。見表 1。

表1 針刺對 PD大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)的影響 (±s,次/min)

表1 針刺對 PD大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)的影響 (±s,次/min)

注：與模型組比較,★P＜0.01。

正常組 0假手術(shù)組 0模型組 9.37±0.10電針組 8.49±0.15 4.90±0.37★藥物組 7.58±0.14 3.58±0.41★

4.2 紋狀體多巴胺能神經(jīng)元凋亡的檢測

治療前模型組、電刺組、藥物組之間 PD大鼠細胞凋亡無顯著性差異,治療后電針組、藥物組 PD大鼠細胞凋亡明顯少于模型組(P＜0.01)。其中電針組和藥物組無明顯差異(P＞0.05)。見表 2。

表2 針刺治療對PD模型大鼠細胞凋亡平均光密度的影響 (±s)

表2 針刺治療對PD模型大鼠細胞凋亡平均光密度的影響 (±s)

注：與模型組比較,★P＜0.01。

組別(每組 12只) 治療前 治療后正常組 0.35±0.07假手術(shù)組 0.41±0.08模型組 28.67±4.48電針組 29.06±5.87 14.50±3.19★藥物組 30.23±7.01 15.47±3.68★

5 討論

中醫(yī)認為本病為“內(nèi)風”所致,肝主風,主筋,本病的主癥震顫、強直、運動減少等均為筋脈失養(yǎng)的表現(xiàn),

所以選擇電針“舞蹈震顫區(qū)”作為治療手段,同時也填補了國內(nèi)外無電針舞蹈震顫區(qū)治療震顫麻痹的動物實驗研究[13],研究結(jié)果顯示,模型組中腦黑質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡陽性數(shù)最高,電針治療、美多巴治療后神經(jīng)細胞凋亡陽性數(shù)明顯減少[14](P＜0.001)。但是兩個治療組之間神經(jīng)細胞凋亡陽性數(shù)無明顯差異(P＞0.05)。本研究結(jié)果提示電針治療 PD行為學變化可能是通過抑制中腦黑質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡起作用的,其效應和美多巴治療接近。為臨床提供了一種簡、便、廉、效的治療方法,至于其抑制中腦黑質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡的具體作用途徑尚有待進一步深入研究。

[1] 陶懷玉.電針加穴位注射治療震顫麻痹 42例臨床觀察[J].中國針灸,1989,9(5)：17

[2] 羅明富.電針治療震顫麻痹的實驗研究[J].中國針灸,1994,14(5)：39

[3] 羅恩麗,趙法政,李桂芝 .針刺蒼白球內(nèi)側(cè)部治療帕金森病模型大鼠 NOS的影響[J].針灸臨床雜志,2007,23(1)：54-55

[4] 戚秀杰,王順 .針灸治療帕金森病臨床研究進展 [J].針灸臨床雜志,2007,23(7)：69-70

[5] 龔譽華,遲艷茹,程為平 .針灸治療帕金森病的臨床經(jīng)驗[J].針灸臨床雜志,2008,24(9)：54-55

[6] 王淑杰,高維濱 .頭針配合電項針治療帕金森病 30例[J].針灸臨床雜志,2008,24(11)：16-17

[7] 李云梅.電針結(jié)合祛風止動顆粒治療帕金森病大鼠模型的實驗研究[J].針灸臨床雜志,2009,25(7)：50-51

[8] Perese DA,Ulman J,Viola J,et al.A6-hydroxydopamine-induced selective parkinsonian rat model[J].Brain Res,1989,494-285

[9] Thomas J,Wang J,Takubo H,et al.A6-hydroxydopamine-induced selective parkinsonian rat model：further biochemical and behavioral characterization[J].Exp Neurol,1994,126：159.

[10] Pellegrino LJ,Pellegrino AS,Cushman AJ.A stereotaxic atlas of the rat brain.2 nd edition[M].Plenum press,1979：43

[11] Ziv I,Melamed E,Nardi N,et al.Dopamine induces apoptosis-like cell death in cultured chick sympathetic neurons：a possible novel patho-genetic in Parkinson's disease[J].Neurosci Letter,1994,170：136

[12] Tompkins MM,Basgall EJ,Zamrini E,et al.Apoptotic-like changes in Lewy-body-associated disorders and normal aging in substantial ni-gral neurons[J].Am J Pathol,1997,150(1)：119

[13] 張旺明,徐如祥,蔡穎謙,等.6-羥基多巴胺誘導帕金森病模型鼠黑質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡[J].中華老年醫(yī)學雜志,2000,19(2)：119-121

[14] SUN Zhong-ren,LI Xiao-ning,ZHAO Yu-hui.Gene control of acupuncture and moxibustion preconditioning on apoptosis in ischemic cardiac muscle of rats with re-perfusion[J].哈爾濱工業(yè)大學學報(英文版),2008,15(3)：341