岳 兵，薛曉鋒,2，吳黎明，李 熠，趙 靜,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100093；2.國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂業(yè)分中心，北京 100093)

高效液相色譜法測定蜂王幼蟲中輔酶Q10含量

岳 兵1，薛曉鋒1,2，吳黎明1，李 熠1，趙 靜1,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100093；2.國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂業(yè)分中心，北京 100093)

建立一種用高效液相色譜測定蜂王幼蟲中輔酶Q10含量的方法。蜂王幼蟲樣品研磨均質(zhì)后，經(jīng)無水乙醇-正己烷液/液萃取，提取液經(jīng)濃縮后，無水乙醇定容。以甲醇為流動相，采用XBridge shield RP18柱分離，在紫外檢測器275nm波長處對樣品中的輔酶Q10進(jìn)行測定。輔酶Q10在12min內(nèi)得到較好的分離，方法線性良好，回收率為95.0%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于8%，檢出限為0.23mg/L。該方法操作簡單、準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，適用于測定蜂王幼蟲中輔酶Q10的含量，已被用于分析一些實際樣品，調(diào)查輔酶Q10在蜂王幼蟲樣品中的含量情況。

輔酶Q10；蜂王幼蟲；液/液萃?。桓咝б合嗌V

輔酶Q10(CoQ10)是一種醌類化合物，又叫癸烯醌、泛醌，為脂溶性醌類化合物，化學(xué)名稱2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌，因其異戊烯基的聚合度為10而得名(即n=10)，如圖1所示。1957年從牛心線粒體中分離得到[1]，廣泛存在于生物體中。輔酶Q10的生物活性主要來自于其醌環(huán)的氧化還原特性和其側(cè)鏈的理化性質(zhì)。它是細(xì)胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑和細(xì)胞代謝激活劑[2]。它的作用是清除氧自由基、維護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整性、穩(wěn)定細(xì)胞膜、抑制自由基形成和增強(qiáng)免疫活性[3]。因此，輔酶Q10已經(jīng)逐漸成為保健食品、化妝品等評價的重要指標(biāo)。

蜂王幼蟲即蜂皇胎，也稱蜂王胎、蜂子等，是由蜜蜂受精卵孵化而成的，專門食用蜂皇漿，長成后即為蜂王，是一種營養(yǎng)物質(zhì)、生物活性物質(zhì)極為豐富的

生物資源，但其體內(nèi)的輔酶Q10的含量尚無文獻(xiàn)報道。本研究對蜂王幼蟲中輔酶Q10進(jìn)行測定，旨在建立一種定量蜂王幼蟲中輔酶Q10的高效液相色譜法，以進(jìn)一步證明蜂王幼蟲的食用、保健價值。

圖1 輔酶Q10分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of coenzyme Q10

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂王幼蟲 浙江平湖種蜂場。

輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；甲醇(色譜純)、正己烷(色譜純)、無水乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、WatersTM486紫外-可見光波長檢測器、Empower 2工作站 美國Waters公司；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；UV-2550光譜儀 日本島津公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；舒美KQ218超聲清洗儀 中國昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取25mg輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品溶于100mL無水乙醇，配成250μg/mL的儲備液，在避光條件下4℃保存。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用無水乙醇稀釋并在棕色容量瓶中定容得質(zhì)量濃度分別為1、10、50、100、250μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

蜂王幼蟲自王臺中取出后，用生理鹽水洗去蟲體附著的王漿，濾去水分，裝入樣品瓶，冷凍保存。實驗時，將樣品冷凍研磨，均質(zhì)后，根據(jù)樣品含量，稱取4g左右樣品(凍干粉1g)，精確至0.0001g，置于50mL棕色容量瓶中，加無水乙醇20mL，超聲提取5min后，加20mL正己烷萃取，振蕩、搖勻，分層后取上清液，反復(fù)萃取3次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后，加2mL無水乙醇溶解，過0.22μm濾膜，避光、4℃保存，待測定。

1.5 色譜條件

色譜柱：XBridgeTMshield RP18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：100%甲醇；色譜柱溫度：30℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣體積：5μL；檢測波長：275nm。以保留時間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的選擇

呂春茂等[4]比較了輔酶Q10的幾種提取方法，分別選用了無水乙醇、正己烷、丙酮幾種溶劑。該實驗在對蜂王幼蟲實際樣本的研究基礎(chǔ)上，比較無水乙醇和正己烷兩種提取劑，通過對樣品進(jìn)行提取、比較，結(jié)果顯示：用正己烷提取的雜質(zhì)較少，樣品凈化的比較好，但回收率偏低，而用無水乙醇提取的雜質(zhì)比較多，但回收率較高(表1)，分別用兩種溶劑提取的效果的差異與輔酶Q10的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，輔酶Q10更容易溶于極性更強(qiáng)的乙醇。鑒于此，確定了樣品的處理方法：用乙醇和正己烷進(jìn)行液液萃取。

表1 比較不同提取方法對蜂王幼蟲中的輔酶Q10的提取效果(n=3)Table 1 Extraction recovery (the average values of 3 replicates) of coenzyme Q10with n-hexane followed by absolute ethanol or each of them alone (n=3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

文獻(xiàn)報道用于測定輔酶Q10的色譜柱有Zobax SB C18、Waters C18、TSK C18、Symmetry C18等[5-8]幾種色譜柱，均屬于C18柱，因此，該研究以C18柱為考察對象，同時考察了Zobax SB C18、Symmetry C18和XBridgeTMshield RP18柱。發(fā)現(xiàn)，不同色譜柱對輔酶Q10的分離情況影響不大，但XBridgeTMshield RP18分離效果好、分析時間短，因此選用XBridgeTMshield RP18作為分析色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

圖2 蜂王幼蟲樣品的色譜圖(a)和輔酶Q10標(biāo)樣的色譜圖(b)Fig.2 HPLC chromatograms of queen bee larva (a) and coenzyme Q10 standard (b)

乙腈、四氫呋喃、正己烷、乙醇、甲醇和異丙醇可用作測定輔酶Q10的流動相[9-11]，該實驗比較乙腈、甲醇和異丙醇3種流動相，實驗結(jié)果表明：乙腈、異丙醇的洗脫能力過強(qiáng)，出峰時間過快，與雜質(zhì)峰無法分開。當(dāng)用甲醇作為流動相時，輔酶Q10的色譜峰能很好地和溶劑峰、雜質(zhì)峰分離，在此條件下，標(biāo)樣和實際樣品的色譜見圖2。

2.3 檢測波長的選擇

根據(jù)輔酶Q10的紫外光譜圖(圖3)可以看出其最大特征波長為202nm，另一特征波長為274.5nm。由于202nm屬于紫外末端吸收，在此波長處，樣品的測定受到基質(zhì)的干擾嚴(yán)重。故將檢測波長定在274.5nm左右，所以選定在275nm，這樣基質(zhì)本身較小的雜質(zhì)峰就不再顯現(xiàn)，從而可以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。圖3為輔酶Q10的紫外光譜圖。

圖3 輔酶Q10的紫外光譜圖Fig.3 UV-visible absorption spectrum of coenzyme Q10

2.4 線性范圍和檢出限

從1、10、50、100、250μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別移取適量輔酶Q10，進(jìn)樣5μL，并以峰面積對質(zhì)量濃度做回歸方程。按上述色譜條件分析，結(jié)果表明，在1～250μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系：Y=10623X－11529(R2=0.9999)。檢出限為0.23mg/L (RSN=3)。

2.5 方法加標(biāo)回收率和精密度

采用在實際樣品(蜂王幼蟲)中添加1、10、50mg/kg 3個水平標(biāo)樣，測定方法的回收率和精密度，每個水平平行分析6次(n=6)。不同添加水平下，輔酶Q10的回收率為95.0%～101.8%，RSD均小于8%，見表2。

表2 輔酶Q10的加標(biāo)回收率(n=6)Table 2 Average recoveries of 6 replicates for coenzyme Q10in a real sample spiked at 3 levels

2.6 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法測定一些來自蜂場蜂王幼蟲與市場的蜂王幼蟲凍干粉樣品中的輔酶Q10的含量，分析結(jié)果見表3。

表3 實際樣品中輔酶Q10測定結(jié)果Table 3 Results of determination of coenzyme Q10in fresh and commercial lyophilized queen bee larvae samples

從表3可以看出，從蜂場取出的新鮮蜂王幼蟲樣品中，輔酶Q10的含量明顯低于來自市場的蜂王幼蟲凍干粉，有的甚至低幾倍。這種結(jié)果說明，蜂王幼蟲經(jīng)過濃縮、加工制成商品蜂王幼蟲凍干粉后，輔酶Q10也得到了富集。調(diào)查了幾種保健產(chǎn)品和天然產(chǎn)物含量，都低于蜂王幼蟲和其市售的蜂王幼蟲凍干粉?？梢?，蜂王幼蟲的保健價值非常高。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種高效液相色譜方法并對蜂王幼蟲中輔酶Q10進(jìn)行了定量測定，本方法快速、簡單、準(zhǔn)確，適用于測定蜂王幼蟲及凍干粉中輔酶Q10。應(yīng)用本方法對市場上的一些蜂王幼蟲產(chǎn)品中的輔酶Q10含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些樣品中輔酶Q10的含量較高，輔酶Q10作為一種活性物質(zhì)，有可能作為一種指標(biāo)來評價蜂王幼蟲的質(zhì)量。

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HPLC Determination of Coenzyme Q10 in Queen Bee Larvae

YUE Bing1，XUE Xiao-feng1,2，WU Li-ming1，LI Yi1，ZHAO Jing1,*
(1. Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Bee Products Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture (Beijing), Beijing 100093, China；2. Apicultural Branch Center, Research and Development Center of National Agro-food Processing Technology, Beijing 100093, China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established to determine coenzyme Q10 in queen bee larvae. Samples were ground and extracted with absolute ethanol under the assistance of ultrasonic and the resulting extract was then reextracted with n-hexane. The n-hexane layer was finally condensed by rotation evaporation and rediluted with absolute ethanol. The chromatographic separation was achieved on an XBridge shield RP18column using methanol as a mobile phase prior to UV detection at 275 nm wavelength. Results showed that a good separation of coenzyme Q10 was observed within 12 min. The developed standard curve exhibited good linearity. Average recoveries for coenzyme Q10 in a real sample spiked at 3 levels, each of which was performed in 6 replicates, were within the range of 95.0% to 101.8%, with a RSD of less than 8%. The limit of detection for coenzyme Q10was 0.23 mg/L. The analytical method proved to be simple, accurate, reliable and sensitive so as to be most suitable for the determination of coenzyme Q10 in queen bee larvae. Satisfying results from the analysis of coenzyme Q10in some real samples by the method were obtained.

coenzyme Q10；queen bee larvae；liquid/liquid extraction；high performance liquid chromatography

TS201.4；TS218

A

1002-6630(2010)10-0206-03

2009-09-18

國家蜜蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(nycytx-43)

岳兵(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為蜂產(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：mooncake_333@126.com

*通信作者：趙靜(1956—)，女，研究員，學(xué)士，研究方向為蜂產(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：zhaojingjun@sina.com