李 靜，王 雨，陳華寶，梁立娜*

(戴安中國有限公司應用研究中心，北京 100085)

牛奶中三價鉻和六價鉻的同時提取和檢測方法

李 靜，王 雨，陳華寶，梁立娜*

(戴安中國有限公司應用研究中心，北京 100085)

建立牛奶中三價鉻和六價鉻的同時提取和測定方法。前處理過程中一次完成六價鉻的提取、有機鉻中三價鉻的釋放、三價鉻柱前衍生以及牛奶蛋白沉降。鉻的提取效率高，牛奶基體去除效果好，操作簡單方便。使用IonPac CS5A色譜柱可以在8min內(nèi)完成牛奶中兩種鉻的價態(tài)分析，三價鉻和六價鉻分別以PDCA和DPC作為絡合劑，分別在紫外和可見波長下采用UV-Vis檢測器進行檢測，靈敏度高，基體干擾小。為牛奶的質(zhì)量檢測提供了準確實用的方法。

三價鉻；六價鉻；離子色譜；UV-Vis檢測；牛奶質(zhì)量檢測

日前，某乳業(yè)公司多批次牛奶中被檢出一種名為“皮革水解蛋白粉”的物質(zhì)，該物質(zhì)的生產(chǎn)原料是制革廠的邊角廢料，由于制革過程中需要大量的三價鉻作為鉻鞣劑[1]，因此皮革水解蛋白即使經(jīng)過脫鉻處理也會存在一定量的重金屬鉻[2-3]。這些鉻主要以Cr(Ⅲ)和Cr (Ⅵ)的形態(tài)存在，六價鉻具有很強的毒性，可干擾重要的酶體系，具有致癌和誘發(fā)基因突變的作用[4-5]。三價鉻是人體的一種必需微量元素，在正常食品補給劑量下，三價鉻是無毒的[6]，但較高劑量的三價鉻仍表現(xiàn)出細胞毒性反應，長期的累積毒性還有待于進一步的研究[7]。由于三價鉻和六價鉻可以通過氧化還原作用相互轉(zhuǎn)化[8]，并且都具有一定毒性，因此對于含“皮革水解蛋白粉”的乳制品，同時檢測其中三價鉻和六價鉻的含量具有重要意義。

原子吸收和發(fā)射光譜等方法只能檢測鉻的總量；直接分光光度法檢測時兩種鉻精確度難以保證。有文獻報道用離子色譜分離，UV或電感耦合等離子體質(zhì)譜同時檢測三價鉻和六價鉻[9-10]，用UV檢測的方法中六價鉻沒有經(jīng)過絡合，因而靈敏度較低。本方法中對三價鉻和六價鉻分別進行柱前和柱后衍生，并分別在紫外和可見波長條件下采用UV-Vis檢測器進行檢測，以提高兩種鉻的檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛奶 市售。

吡啶-2,6-二羧酸(PDCA，純度99%) Aldrich公司；1,5-二苯卡巴肼(DPC，分析純) 新中化學廠；

Na2HPO4·12H2O(分析純) 國藥集團；NaI·2H2O(優(yōu)級純) 津科精細化工；CH3COONH4(分析純) 北京化學試劑公司；LiOH(56%) ACROS公司；甲醇(色譜純)、硫酸(95%～98%)、硝酸(65%～68%)均為優(yōu)級純 北京化工廠；Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)標準試劑 百靈威公司；超純水(電阻率18.2MΩ/cm)；0.22μm尼龍濾膜 天津賀世科技發(fā)展有限公司。

ICS-3000離子色譜儀、Ultimate 3000可變波長紫外可見檢測器、PC-10柱后衍生裝置、375μL編結(jié)反應管、OnGuardⅡRP前處理柱(1.0mL) 美國Dionex公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：IonPac C S5A(4mm×250mm)分析柱、IonPac CG5A(4mm×50mm)保護柱；淋洗液：2mmol/L PDCA、2mmol/L Na2HPO4、10mmol/L NaI、50mmol/L CH3COONH4、2.8mmol/L LiOH混合水溶液；衍生試劑：2mmol/L DPC、10%(V/V)甲醇、2.5%(V/V)硫酸；淋洗液流速：1.0mL/min；衍生液流速：0.5mL/min；檢測波長：0～4.3min、365nm (Cr(Ⅲ)檢測波長)，4.3～8min、530nm (Cr(Ⅵ)檢測波長)。

1.3 溶液配制

1.3.1 淋洗液儲備液的配制

配制20mmol/L吡啶-2,6-二羧酸(PDCA)、20mmol/L Na2HPO4、100mmol/L NaI、500mmol/L CH3COONH4和28.0mmol/L LiOH混合水溶液。PDCA溶解速度較慢，可略微加熱促進其溶解，所有溶質(zhì)完全溶解后真空抽濾，濾去不溶性雜質(zhì)。

1.3.2 淋洗液的配制

將100mL淋洗液儲備液用超純水稀釋到1L，稀釋后淋洗液的pH值應在6.70～6.80之間。

1.3.3 柱后衍生液的配制

將0.5g 1,5-二苯卡巴肼(DPC)溶解在100mL甲醇中。在約500mL去離子水中加入濃硫酸25mL。將上述兩種溶液混合，并用超純水準確定容至1L，所得溶液真空抽濾，濾去不溶性雜質(zhì)。

1.3.4 三價鉻和六價鉻混合標準溶液的配制

取1000mg/L的三價鉻標準溶液1.0mL，1000mg/L的六價鉻標準溶液0.1mL，置于同一個50mL的容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，該溶液中三價鉻質(zhì)量濃度為20mg/L，六價鉻質(zhì)量濃度為2mg/L。

分別取上述溶液0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0mL于8個10mL容量瓶中，再分別加入1mL淋洗液儲備液，煮沸1min，溶液體積較少時，可加入1mL超純水以免煮干，冷卻后定容至刻度，獲得兩種鉻的混合標準溶液系列。

1.3.5 樣品溶液的制備

在一個50mL容量瓶中，按順序加入牛奶或牛奶加標樣品0.5mL，超純水4.5mL，淋洗液儲備液5mL，33%硝酸0.1mL，煮沸2～3min，冷卻定容后過0.22μm濾膜和OnGuard Ⅱ RP前處理柱，流出液棄去前面的3mL，收集后面流出液用于進樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件和檢測波長的選擇

利用吡啶二羧酸鉻(CrⅢ-PDCA)的紫外吸收和二苯卡巴肼鉻(CrⅥ-DPC)在可見光區(qū)的吸收來進行檢測。由于三價鉻的配位交換的動力較弱，所以需要進行柱前衍生生成Cr(Ⅲ)-PDCA，進樣后在分析柱中以Cr(PDCA)2－的形式被分離，而六價鉻則以鉻酸根離子(CrO42－)的形式被分離出來。在分離之后再采用柱后衍生生成Cr(Ⅵ)-DPC，兩種物質(zhì)在不同波長處進行檢測。

本實驗中三價鉻的檢測波長為365nm，這雖不是三價鉻的最大吸收波長，但在該波長處檢測可以有效避免牛奶基體對三價鉻檢測的干擾。

兩種鉻的標準品分離譜圖和牛奶加標樣品分離譜圖見圖1和圖2。由圖2可見，牛奶基體對兩種鉻的檢測都沒有干擾，分析快速準確。

圖1 三價鉻和六價鉻標準品分離譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) standards

圖2 牛奶加標樣品分離譜圖Fig.2 Chromatogram of a spiked milk sample

2.2 前處理方法的研究

文獻報道中三價鉻和六價鉻的檢測基體一般為電鍍廢液、制革廢水等，三價鉻和六價鉻都以游離的離子

狀態(tài)存在。而牛奶中的三價鉻會與蛋白質(zhì)上的羧基發(fā)生鍵合反應生成有機鉻[2,6]，因此在沉降蛋白之前需要將三價鉻釋放出來。PDCA是三價鉻的絡合劑，將牛奶稀釋10倍后，與等量的淋洗液儲備液混合并加熱，淋洗液儲備液中的PDCA就可以與三價鉻結(jié)合，以離子形式存在于溶液中，這個過程也同時完成了三價鉻的柱前衍生，鉻酸根離子由該溶液同時提取。加入淋洗液儲備液之后，再加入少量的硝酸，煮沸，牛奶中的蛋白會發(fā)生沉降，將該溶液定容到一定體積后，經(jīng)過0.22μm濾膜和On Guard Ⅱ RP前處理柱就可以獲得澄清的溶液。

2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、最小檢出限

采用1.3.4節(jié)中制備的標準溶液，分別對三價鉻和六價鉻8個濃度的標準溶液進樣，考察三價鉻和六價鉻在0.05～10mg/L和0.005～1mg/L內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系，兩者的線性方程分別為y＝1.3965x－0.003和y＝82.6474x－0.012[其中，y為峰面積，x為組分的質(zhì)量濃度/(mg/L)]，相關(guān)系數(shù)均為0.9999。

以信噪比3:1為檢出限，三價鉻和六價鉻的最小檢出質(zhì)量濃度分別為23.3μg/L和0.4μg/L。以信噪比10:1為定量限，三價鉻和六價鉻的最小定量質(zhì)量濃度分別為77.5μg/L和1.3μg/L。

2.4 方法重現(xiàn)性

取三價鉻和六價鉻質(zhì)量濃度為0.5mg/L和0.05mg/L的混合標準溶液，連續(xù)進樣6次，測得峰面積相對標準偏差(RSD)分別為2.3%和1.1%。

2.5 樣品分析和回收率

為了考察本方法對實際牛奶樣品的分析效果，檢測了市場上購買到的幾種純牛奶，均不含有三價鉻和六價鉻，故需向牛奶中添加一定量的三價鉻和六價鉻，進行加標回收率測定。選擇某品牌純牛奶，向其中加入一定量的三價鉻標準溶液，加標回收率見表1。三價鉻的回收率良好，該方法對三價鉻的測定準確可靠。

表1 三價鉻加標回收率Table 1 Recoveries for chromium (Ⅲ) in a commercial milk sample (neither chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) detected) spiked at 3 levels

在5mL (V牛奶)牛奶中加入一定體積(V加)的1000mg/L (cCrⅥ標)的六價鉻標準溶液，按照1.3.5節(jié)的前處理方法和1.2節(jié)的色譜條件進行分析，加標回收結(jié)果見表2?？梢?，實測值(c實)與添加水平(c加)不相等，其差值接近一個恒定的數(shù)值(c差)。由于六價鉻的定量限可達0.0013mg/L，因此加入水平為0.04mg/L時，應該就可以檢測到一個比較高的色譜峰，但在加標回收實驗中根本檢測不到六價鉻，卻檢測到了三價鉻，其他加標水平中三價鉻的檢出量基本等于六價鉻的減少量。這是因為牛奶中存在一些天然的還原性物質(zhì)[11]，會使六價鉻定量的還原為三價鉻，如果設這種還原性物質(zhì)的質(zhì)量濃度為a(mg/L)，通過下式可以計算出a值，其值也接近一個常數(shù)。

(V加×cCrⅥ標)－(a×V牛奶)= c差×V牛奶

表2 5mL牛奶中六價鉻加標回收數(shù)據(jù)Table 2 Recoveries for chromium chromium (Ⅵ) in 5 mL of a blank milk sample spiked at 5 levels

為了進一步證明牛奶中還原性物質(zhì)的存在，以及它對六價鉻的影響，在所有前處理方法和檢測方法不變的情況下，向2.5mL牛奶中添加六價鉻標準溶液，那么2.5mL牛奶使六價鉻的減少質(zhì)量(m差)應為5mL牛奶的一半，加標回收數(shù)據(jù)見表3。

表3 2.5mL牛奶中六價鉻加標回收數(shù)據(jù)Table 3 Recoveries for chromium chromium (Ⅵ) in 2.5 mL of a blank milk sample spiked at 5 levels

由表3可見，2.5mL牛奶中六價鉻的減少量(m差)近似為5mL牛奶減少量的一半，并且計算得到的a值也近似相等。證明了六價鉻的回收率降低是由牛奶中還原性物質(zhì)引起的，進一步的實驗數(shù)據(jù)顯示，不同品牌牛奶中該還原性物質(zhì)的濃度可能有較大差別。

本方法使用的牛奶均為不添加任何抗氧化劑的純牛奶，還原性物質(zhì)是牛奶中天然存在的，但牛奶中人為添加的還原性物質(zhì)同樣可以使六價鉻轉(zhuǎn)化為三價鉻。因此添加了皮革水解蛋白的牛奶，必須同時檢測其中三價

鉻和六價鉻的含量，所得數(shù)據(jù)才能比較正確地反映牛奶中六價鉻的加入量。

但是有些配方奶粉中確實添加了三價鉻作為有益微量元素，這時是否檢測到六價鉻是牛奶中三價鉻來源的判斷依據(jù)，因此需要對三價鉻和六價鉻進行分別檢測。本方法對六價鉻的檢出限很低，只要檢測到六價鉻，就可以對三價鉻的來源進行判斷。同時正常牛奶中含三價鉻5～16μg/kg[12]，如果檢測到三價鉻含量異常升高，也應對三價鉻來源進行進一步確認。

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種牛奶中三價鉻和六價鉻的同時提取和測定方法，前處理方法高效簡單快速，檢測方法靈敏準確，并且應用該方法對牛奶中三價鉻和六價鉻的存在方式，以及與牛奶中物質(zhì)的相互作用等方面進行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明對于添加皮革水解蛋白的牛奶，需要同時檢測三價鉻和六價鉻的含量，并給出了判斷三價鉻來源的依據(jù)。為牛奶的質(zhì)量檢測提供了準確實用的方法。

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Simultaneous Extraction and Determination of Chromium (Ⅲ) and Chromium (Ⅵ) in Milk

LI Jing，WANG Yu，CHEN Hua-bao，LIANG Li-na*
(Application Research Center, Dionex China, Beijing 100085, China)

A method was developed for the simultaneous extraction and determination of chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) in milk. One pretreatment process was required for chromium (Ⅵ) extraction, the release of chromium (Ⅲ) from organic chromium, chromium (Ⅲ) pre-column derivatization and milk protein sedimentation, which exhibited simplicity, convenience and high extraction efficiency of chromium. The separation of chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) was achieved on an IonPac CS5A column within 8 min. Chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) were chleated with PDCA and DPC and were detected with a UV-Vis detector at UV and visible wavelengths, respectively. This work provides an accurate and practical method for milk quality evaluation.

chromium (Ⅲ)；chromium (Ⅵ)；ion chromatography；UV-Vis detection；milk quality testing

O657.32

A

1002-6630(2010)10-0250-04

2009-07-04

李靜(1982—)，女，碩士，研究方向為離子色譜分析。E-mail：lijing@dionex.com.cn

*通信作者：梁立娜(1976—)，女，博士，研究方向為液相及離子色譜分析。E-mail：lianglina@rcees.ac.cn