劉 冰，徐誠蛟，王愛杰

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090，waj0578@hit.edu.cn; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽110866;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030)

從19世紀(jì)70年代的石油危機(jī)開始，利用有機(jī)廢物產(chǎn)生生物質(zhì)能被認(rèn)為是一個(gè)重要的產(chǎn)能途徑［1］.我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生大量纖維素類的農(nóng)業(yè)廢棄物，利用生物手段將其轉(zhuǎn)化為高附加值的生物質(zhì)能成為研究熱點(diǎn)［2］.其中，降解纖維素產(chǎn)糖是這項(xiàng)研究的核心內(nèi)容之一［3－5］.在人們追求糖產(chǎn)量的同時(shí)，如何能更準(zhǔn)確的將產(chǎn)出的糖量測(cè)定出來成為一個(gè)熱點(diǎn)問題.由于在復(fù)合菌系內(nèi)，微生物對(duì)還原糖利用的瞬時(shí)性，通過測(cè)定反應(yīng)體系中殘留的還原糖量，很難準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)其糖化能力.本試驗(yàn)采用分室同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫的培養(yǎng)模式，將從高溫堆肥中篩選得到降解水稻秸稈的復(fù)合菌系，與實(shí)驗(yàn)室原有只能代謝單糖高產(chǎn)氫菌株YUAN-3(Ethanoligenens harbinense)［6］分室同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)，以單獨(dú)利用葡萄糖為底物發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生氫氣與所消耗葡萄糖的比例關(guān)系為對(duì)照，研究同步培養(yǎng)時(shí)復(fù)合菌系降解秸稈產(chǎn)生還原糖的能力，從而對(duì)厭氧纖維素降解菌系生物糖化效果進(jìn)行評(píng)估.

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養(yǎng)基配制

復(fù)合菌系分離樣品取自高溫牛糞堆肥.實(shí)驗(yàn)室原有菌株YUAN－3(E.harbinense)，該菌株有較強(qiáng)的產(chǎn)氫能力，同時(shí)又具備自凝集特性，該菌僅能利用單糖產(chǎn)氫.試驗(yàn)所需培養(yǎng)基分別為:秸稈培養(yǎng)基(L－1):NH4Cl 1.0 g，K2HPO43.5 g，KH2PO41.5 g，MgCl20.5 g，NaCl 1.0 g，KCl 0.2 g，半胱氨酸0.5 g，蛋白胨2.0 g，酵母粉2.0 g，秸稈 5 g，維生素液［7］5 mL，微量元素溶液［7］1 mL，刃天青1.5 mg，pH 7.0.YUAN-3培養(yǎng)基［8］.濾紙液體培養(yǎng)基［9－10］.將各種培養(yǎng)基分裝于血清瓶?jī)?nèi)，全過程在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下進(jìn)行，121℃，20 min高壓滅菌.

1.2 產(chǎn)糖復(fù)合菌系的富集與篩選

1.2.1 復(fù)合菌系的富集

取高溫堆肥樣品10 g，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，投入裝有數(shù)顆玻璃珠的無氧無菌水中，在振蕩器中振蕩1 h，利用玻璃珠剪切力將堆肥樣品粉碎，使微生物菌體充分分散于體系中.再將混合體系接種于秸稈培養(yǎng)基中，接種量10%，35℃靜止富集培養(yǎng)10 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次，使降解纖維素菌株大量富集.

1.2.2 秸稈降解效果

采用濾紙崩解法.將富集得到的菌群接入到濾紙培養(yǎng)基中培養(yǎng)，濾紙?jiān)谂渲婆囵B(yǎng)基前需烘干恒重后稱重，接種量為10%，35℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，7～10 d后，烘干稱重，測(cè)量濾紙的崩解情況.反復(fù)轉(zhuǎn)接3次，比較濾紙崩解的效果.

1.2.3 連續(xù)稀釋轉(zhuǎn)接篩選高產(chǎn)糖復(fù)合菌系

將篩選得到的利用濾紙效果好的菌系用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋度為10－3～10－9的溶液分別接種到水稻秸稈培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).每隔24 h小時(shí)取樣，采用DNS比色法［11－12］測(cè)定還原糖量.總結(jié)數(shù)據(jù)，當(dāng)還原糖量升高，及時(shí)將該稀釋度培養(yǎng)體系再度稀釋至10－3～10－9，分別接入到新鮮秸稈培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)，如此連續(xù)稀釋以得到高產(chǎn)糖復(fù)合菌系.

1.3 產(chǎn)糖效果評(píng)價(jià)方法及裝置

為更好的研究降解纖維素復(fù)合菌系的產(chǎn)糖效果，將其與已知菌株YUAN－3進(jìn)行分室同步糖化發(fā)酵，根據(jù)復(fù)合菌系與YUAN－3分別培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生單位體積H2時(shí)的底物利用率，研究分室同步培養(yǎng)條件下復(fù)合菌系的產(chǎn)糖效果.將篩選得到產(chǎn)糖效果較好的復(fù)合菌系接種于如圖1所示反應(yīng)器的A室，B室接種YUAN－3，A、B兩室以0.45 μm細(xì)菌濾膜分隔，單室容積32 mL，裝液量80%，以添加于A室的水稻秸稈段為惟一碳源，流加無碳源培養(yǎng)液，采用單批培養(yǎng)方法，以分別單室培養(yǎng)為對(duì)照，測(cè)定反應(yīng)器A、B室及對(duì)照產(chǎn)氫量變化規(guī)律，對(duì)照的葡萄糖消耗量，反應(yīng)體系內(nèi)還原糖含量殘留量.氫氣測(cè)定、發(fā)酵液相末端代謝產(chǎn)物的測(cè)定采用美國安捷倫7890型氣相色譜儀測(cè)定.色譜柱:TDX－02;柱溫:100℃;汽化室:80℃;檢測(cè)器100℃.

圖1 雙室反應(yīng)器裝置簡(jiǎn)圖

1.4 復(fù)合菌系糖化能力計(jì)算與秸稈降解率測(cè)定

分別測(cè)定復(fù)合菌系和YUAN－3在單室反應(yīng)器中，累積產(chǎn)氫量與葡萄糖消耗量，并根據(jù)兩者的比例關(guān)系擬合成回歸曲線方程.再將雙室反應(yīng)器中復(fù)合菌系和YUAN－3的產(chǎn)氫量分別代入方程，求得不同時(shí)間產(chǎn)生一定體積的氫氣，所需消耗的還原糖量，以此來表述復(fù)合菌系降解秸稈的產(chǎn)糖效果.秸稈降解率=(原始秸稈質(zhì)量－殘留秸稈質(zhì)量)/原始秸稈質(zhì)量×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合菌系的富集結(jié)果

富集得到的復(fù)合菌系JY在水稻秸稈培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，說明具有降解纖維素能力.分別觀察其在濾紙培養(yǎng)基中培養(yǎng)7，9，11 d后的濾紙崩解程度，通過培養(yǎng)觀察得到，圖2中復(fù)合菌系JY在第11天能將濾紙完全降解成糊狀，說明其具有較好利用纖維素底物的能力.

圖2 濾紙崩解效果

2.2 篩選到的復(fù)合菌系及其產(chǎn)糖效果

將復(fù)合菌系 JY進(jìn)行梯度稀釋后接種于50 mL秸稈培養(yǎng)基，每天測(cè)定反應(yīng)體系內(nèi)還原糖產(chǎn)量，當(dāng)產(chǎn)糖量升高時(shí)，說明利用秸稈的厭氧產(chǎn)糖微生物活躍，及時(shí)稀釋轉(zhuǎn)接，如此反復(fù)，從而得到產(chǎn)糖量較高的復(fù)合菌系.從表1看出，在稀釋培養(yǎng)后的第2天，所有稀釋度還原糖量均有所下降，下降最快為JY6(JY稀釋為10－6)，而在第3天其還原糖量又迅速上升，達(dá)到0.088 5 mg/mL.此時(shí)將JY6再進(jìn)行梯度稀釋轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接后的第2天，JY66(JY6稀釋為10－6)還原糖含量迅速上升達(dá)到0.148 6 mg/mL.再將JY66再進(jìn)行梯度稀釋，同樣在轉(zhuǎn)接后的第2天，JY665(JY66稀釋為10－5)的還原糖含量上升達(dá)到最高值0.165 6 mg/mL，而后還原糖量開始下降.由此可見，通過測(cè)定還原糖量并及時(shí)稀釋轉(zhuǎn)接，可以將復(fù)合菌系的微生物結(jié)構(gòu)向產(chǎn)糖微生物更活躍，產(chǎn)糖效率更高的方向馴化.得到一個(gè)降解纖維素產(chǎn)糖能力較強(qiáng)的菌系，并且產(chǎn)糖量會(huì)在接種后的第2天達(dá)到最大值.結(jié)果還表明，稀釋度10－5或10－6對(duì)復(fù)合菌系內(nèi)的產(chǎn)糖類群具有較好的分離度，即產(chǎn)糖微生物類群占所在菌系的比例較高，而隨時(shí)間推移，產(chǎn)生的還原糖很快會(huì)被其它微生物類群利用，還原糖含量隨即下降.

2.3 復(fù)合菌系的產(chǎn)糖效果評(píng)價(jià)

利用DNS法只能測(cè)得體系中殘留的少量還原糖，無法反應(yīng)菌系降解秸稈過程中，產(chǎn)生還原糖的量和變化動(dòng)態(tài).本研究利用同步分室培養(yǎng)的方法，利用反應(yīng)器中氫產(chǎn)量來推算菌系降解秸稈產(chǎn)糖能力.

將產(chǎn)糖效果較好的復(fù)合菌系JY665接種于雙室反應(yīng)器A室，將菌株YUAN－3接種于B室，以利用單室反應(yīng)器分別培養(yǎng)JY菌系和YUAN－3作為對(duì)照，35℃下振蕩培養(yǎng)80 h.將JY復(fù)合菌系和YUNA－3對(duì)照產(chǎn)氫體積(ml)對(duì)消耗葡萄糖的質(zhì)量(g)擬合方程，分別為Y=－0.000 5x2+ 0.012 1x+0.011 3(R2=0.934 3)和Y=－0.000 07x2+ 0.006 4x+0.001 3(R2=0.999 6)，且擬合度較高(如圖3).

圖3 產(chǎn)氫量對(duì)葡萄消耗量擬合曲線

圖4 反應(yīng)器產(chǎn)氫氣變化動(dòng)態(tài)

雙室反應(yīng)器JY復(fù)合菌系和YUAN－3，80 h累積產(chǎn)氫氣量如圖所示，80 h時(shí)產(chǎn)氣累積量達(dá)到最大值分別為9.45 mL和14.40 mL.其中JY復(fù)合菌系產(chǎn)氣量穩(wěn)步上升，而YUAN－3則呈波動(dòng)上升，可能是由于還原糖透過細(xì)菌濾膜時(shí)不均勻擴(kuò)散造成的.YUAN－3的產(chǎn)氫起始時(shí)間為20 h，而JY復(fù)合菌系為32 h，說明由于JY的菌系復(fù)雜性使還原糖被消耗而產(chǎn)氫起始時(shí)間滯后.將反應(yīng)器雙室所產(chǎn)生氫氣量(圖4)代入JY復(fù)合菌系和YUNA－3對(duì)照的回歸曲線方程，得到反應(yīng)體系內(nèi)還原糖消耗量的變化值，并與利用DNS法測(cè)得的反應(yīng)器殘留還原糖值進(jìn)行對(duì)比.

結(jié)果(圖5)表明，JY復(fù)合菌系和YUAN－3在發(fā)酵過程中所消耗的還原糖量在不斷升高，在80 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為0.081 0 g和0.083 8 g，總還原糖消耗量達(dá)到了0.164 8 g.水稻秸稈添加量為0.320 0 g，培養(yǎng)結(jié)束后水稻秸稈殘留為0.124 6 g，據(jù)此JY復(fù)合菌系，產(chǎn)糖能力達(dá)到0.515 0g/g秸稈，秸稈降解率達(dá)到61.06%.

圖5 反應(yīng)器產(chǎn)生及殘留還原糖量

同時(shí)，利用DNS法測(cè)定了反應(yīng)體系中的殘留的還原糖量，反應(yīng)器內(nèi)JY復(fù)合菌系和YUAN－3還原糖含量均較低，最高值也分別只有3.310 mg和3.005 mg，且動(dòng)態(tài)變化并不規(guī)律.結(jié)果表明，在秸稈降解的過程中，可能還原糖在產(chǎn)生后便被及時(shí)利用，很難在反應(yīng)體系發(fā)現(xiàn)糖的殘留.由此可見，以產(chǎn)生一定體積氫氣所消耗的葡萄糖量，來表述復(fù)合菌系降解秸稈產(chǎn)生的還原糖量是可行和有效的.

3 結(jié)論

1)利用連續(xù)稀釋轉(zhuǎn)接法，篩選得到能夠降解水稻秸稈產(chǎn)糖的復(fù)合菌系JY665，該菌系35℃條件下降解纖維素產(chǎn)糖效果較好.將所得菌系JY665與產(chǎn)氫菌YUAN－3分室同步糖化培養(yǎng)，以單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)氫氣產(chǎn)量對(duì)還原糖消耗量擬合曲線方程，代入反應(yīng)器產(chǎn)氫量得到復(fù)合菌系產(chǎn)糖能力達(dá)到0.515 0 g/g秸稈，秸稈降解率達(dá)到61.06%.

2)通過擬合產(chǎn)氫體積與消耗葡萄糖量之間的曲線方程，采用分室同步糖化發(fā)酵法，以反應(yīng)體系產(chǎn)氫量推知降解秸稈產(chǎn)生還原糖量，建立了一套關(guān)于復(fù)合菌系產(chǎn)糖能力的間接評(píng)價(jià)方法，并驗(yàn)證了該方法的可行性.

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