常玉廣，馬 放，王 博，王弘宇

(1.哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，哈爾濱150090，changyuguang@yahoo.com.cn; 2.南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院，南京211171)

微生物絮凝劑是微生物在發(fā)酵過程中分泌的高分子聚合物，其主要成分為多糖［1］、蛋白質(zhì)、糖蛋白和DNA等［2－4］，具有高效，無毒，絮凝效果好等特點，對一些工業(yè)廢水、河水、泥漿廢水等有較好的絮凝效果.因此，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生新的復合型生物絮凝劑的前景非常廣闊［5－8］.

近年有關生物絮凝劑的報道較多，但大部分研究集中于微生物絮凝劑的發(fā)酵效果、特性、影響因素的水平，因而能否培育出高效的優(yōu)良絮凝菌種，是今后的主要研究方向，國內(nèi)外學者已篩選到了細菌、真菌等幾十種高效的生物絮凝劑產(chǎn)生菌株［9－10］.由哈爾濱工業(yè)大學馬放教授率先提出的“復合型生物絮凝劑”的概念［5］，是以稻草、秸稈等廉價生物質(zhì)材料為底物，利用纖維素降解菌群和絮凝菌群組成的復合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌菌群，進行兩段式發(fā)酵后分離提取而獲得生物絮凝劑.本文是在“復合型生物絮凝劑”概念的基礎上開展深入研究，從基因水平鑒定絮凝微生物及對其進行分類，并且對產(chǎn)絮菌最佳菌群的構(gòu)建、絮凝試驗以及絮凝成分進行了研究.這不僅是對“復合型生物絮凝劑”概念的實際應用，也為研究絮凝機理及復合型生物絮凝劑的開發(fā)提供了有利的理論基礎.

1 試驗

1.1 材料

1.1.1 菌株

高效絮凝菌來源于含油廢水曝氣池污泥中的泥樣，是由黑龍江省環(huán)境生物技術重點實驗室分離開發(fā)的.

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基:每升含葡萄糖10 g，K2HPO45 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO42 g，NaCl 0.1 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，pH7.5.絮凝菌分離培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基［11］.

1.2 絮凝活性測定

取5 g高嶺土加至1 000 mL的燒杯中，然后依次加入自來水1 000 mL，10%的CaCl2溶液1.0 mL和10 mL發(fā)酵液，并且調(diào)節(jié)溶液 pH至7.2，之后將燒杯溶液放在攪拌儀上攪拌(快攪、慢攪)使之充分混合，靜置 20 min后于波長550 nm處測定吸光度(B).以蒸餾水代替培養(yǎng)液作空白對照，于波長550 nm處測定吸光度(A).

通過絮凝率F來表示絮凝活性，公式如下［12］

1.3 16SrDNA序列的擴增和分析

1.3.1 絮凝菌基因組DNA的提取

方法參照文獻［13］.

1.3.2 16SrDNA序列的PCR擴增反應

PCR反應以基因組DNA為模板，用通用引物擴增16SrDNA片段.正向引物為BSF8/20:5＇－AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG－3＇;反向引物為BSR1541/20:5'－AAGGAGGTG AACCAG CCGCA－3'，引物由大連寶生物公司合成.PCR反應體系(100 μL)為:10×Buffer 10 μL，dNTP 8 μL，引物BSF8/20 3 μL，引物BSR1541/20 3 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，dH2O 74.5 μL.反應程序: 94℃預變性4 min;94℃變性1.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán);然后72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18—T連接后，由大連寶生物基因公司測序.

1.4 絮凝菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得的6株絮凝菌株的16S rDNA序列通過BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫上進行相似性比對分析，調(diào)出同源性99%的菌株16SrDNA序列，并利用序列比對軟件ClustalX1.8、系統(tǒng)發(fā)育分析軟件PHYLIP3.6及進化樹生成軟件Treeview構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和序列同源性的比較.

1.5 絮凝菌的菌群構(gòu)建

將絮凝菌按照(1∶1)比例進行每兩株復配培養(yǎng)，測其絮凝率.

1.6 絮凝劑的成分分析

用紅外光譜掃描分析絮凝劑中的特征基團，確定絮凝劑中的有效成分.

1.7 絮凝劑的成分分析

將絮凝劑粗品分別用紫外掃描測定蛋白質(zhì)、核酸;用紅外光譜掃描分析絮凝劑中的特征基團，確定絮凝劑中的有效成分.

2 結(jié)果與討論

2.1 絮凝菌的形態(tài)特征與生理生化測定

將6株絮凝菌編號為:F1、F2、F3、F4、F5、F6.

圖1 絮凝菌的電鏡觀察圖

由透射電鏡觀察(圖1)，6株菌中只有F1為球狀菌，其余為桿狀菌.這些菌株的菌落形態(tài)都是圓形，直徑較大，表面都光滑，顏色多為乳白色，只有F1菌落為桔紅色，絮凝菌的形態(tài)特征見表1，生理生化特性分析見表2，并參照伯杰氏菌種鑒定手冊，對6株絮凝菌進行菌種鑒定，初步確定F1為庫克菌屬(Kocuria sp.)，F(xiàn)2為農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium sp.)，F(xiàn)3、F4、F5、F6為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.).

表1 絮凝菌體的形態(tài)特性

表2 絮凝菌的生理生化特性

2.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

測序結(jié)果表明:F1、F2、F3、F4、F5、F6的16SrDNA的核甘酸序列為1 518 bp、1 478 bp、1 477 bp、1 477 bp、1 544 bp、1 544 bp(圖2).

圖2 絮凝菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

將6株絮凝菌的16SrDNA序列用BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16SrDNA序列進行同源性比較，選取同源性在95%以上的細菌序列.根據(jù)16S rDNA序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從進化樹可以看出，6株絮凝菌分別與 Bacillus sp.、Agrobacterium sp.、Kocuria Polaris各歸為同一簇族群.其中F3、F4、F5、F6最接近于Bacillus sp.，該菌株在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于芽孢桿菌屬.F1接近于庫克菌屬 Kocuria sp.，F(xiàn)2與農(nóng)桿菌屬Agrobacterium sp.歸為同一族群，利用BLAST的序列比對結(jié)果表明，各菌株與相似性菌屬的相似性均為99%.結(jié)合菌株的形態(tài)學和生理學特性，可基本確定分離的菌株的屬為 Bacillus sp.、Agrobacterium sp.、Kocuria sp..

2.3 絮凝活性的測定

由絮凝菌的電鏡照片來看，F(xiàn)5菌株和F6菌株有大量的粘液性物質(zhì)產(chǎn)生，細菌易粘連在一起，形成膜狀物質(zhì)，說明這兩株菌的分泌代謝很旺盛，而絮凝效果的產(chǎn)生也是來源于微生物的代謝產(chǎn)物，有報道具有絮凝活性的細菌多數(shù)均形成胞外多糖［14］.因此，在絮凝菌發(fā)酵液中含有影響絮凝活性的物質(zhì).結(jié)果表明，絮凝率達69%以上，其中4株絮凝率在80%以上，分別為F2、F3、F5、F6.在混凝過程中，菌株F2的發(fā)酵液混凝產(chǎn)生的礬花大，沉降速度快，從圖3可以看出，F(xiàn)2絮凝率最高，其他菌株也同樣表現(xiàn)了高絮凝特點.

圖3 絮凝菌的絮凝率示意圖

2.4 絮凝菌的菌群構(gòu)建

將絮凝率高于80%的4株絮凝菌F2、F3、F5、F6按照(1∶1)比例進行每兩株復配培養(yǎng)，測其絮凝率.盡管這4株菌單獨培養(yǎng)時絮凝率都在80%以上，但從表3可以看出，每兩株菌混合培養(yǎng)之后，并不是絮凝率都有所提高，有的反而降低了.根據(jù)生態(tài)位的理論［7］，不同菌株能夠在一起共存，是因為它們之間通過協(xié)調(diào)作用出現(xiàn)了生態(tài)位的分離，從而避免了種群間激烈的競爭.因此，混合培養(yǎng)絮凝率較單株菌培養(yǎng)有所降低，這兩株菌之間存在生態(tài)位的重疊，導致它們不能共同生長或生長力下降，影響了代謝產(chǎn)物的增加，也就是絮凝活性物質(zhì)減少，從而絮凝率降低;而F2和F6的混合培養(yǎng)后的絮凝率較原來有一定的提高，說明它們能夠在一起共同生長，其生態(tài)位出現(xiàn)了分離，所以絮凝率提高.由表3可以看出:F2和F6菌株組合所得發(fā)酵液絮凝率為93.1%，其效果優(yōu)于其他各組，同時也優(yōu)于各個單菌.這可以由生態(tài)位來解釋，另外，在Kurane R和Matsuyama研究結(jié)果中也有闡述，混合培養(yǎng)的條件下不同微生物之間的相互作用促進微生物絮凝劑的產(chǎn)生［15］.因此，采用F2和F6作為復合型生物絮凝劑產(chǎn)生菌，用于生產(chǎn)復合型生物絮凝劑，并對這兩株菌進行進一步的研究.

2.5 復合型生物絮凝劑的絮凝活性分布

對復合型生物絮凝劑F2和F6的發(fā)酵原液、上清液、細胞懸浮液三者的絮凝率進行了測定.由圖4可知，發(fā)酵原液活性最高，為96.61%，分別高于上清液、細胞懸浮液1.91%，35.53%.通過絮凝率的測定可知上清液的絮凝率很高，說明絮凝活性物質(zhì)主要存在于上清液中，生物絮凝是利用微生物細胞代謝產(chǎn)物的絮凝劑，絮凝劑有效成分存在于發(fā)酵液中.而細胞懸浮液絮凝的效果較低(相對絮凝劑的效果)，表明絮凝菌產(chǎn)生的胞外物大部分分泌至胞外液中.因此，在后續(xù)的實驗中，以發(fā)酵上清液為對象，來研究生物絮凝劑的分離純化.

表3 不同兩株絮凝菌混合培養(yǎng)的絮凝率

圖4 絮凝活性分布圖

2.6 復合型微生物絮凝劑的成分分析

2.6.1 紫外掃描分析

絮凝菌發(fā)酵液上清液的紫外掃描結(jié)果見圖5.曲線為平滑曲線，沒有特征吸收峰(蛋白質(zhì)在280 nm有吸收峰，核酸在260 nm有吸收峰)，說明絮凝劑中幾乎不含有核酸和蛋白質(zhì).因此，可以定性地判斷該絮凝劑的有效成分不是蛋白質(zhì)或核酸.

2.6.2 紅外光譜掃描

將生物絮凝劑提純后進行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖6.譜圖是較為典型的多糖紅外光譜圖，2 926 cm－1是C—H不對稱伸縮振動的結(jié)果，此區(qū)域的吸收峰是糖類的特征峰.1 647 cm－1是由于多糖中的乙酰氨基(—NHCOCH3)的C O鍵伸縮振動造成的.在圖中1 541 cm－1和1 508 cm－1處的峰為 N—H的變角振動，此峰說明多糖中的—NH—是乙?；?在3 443 cm－1處強而寬的吸收峰是分子內(nèi)的—OH伸縮振動所導致的.1 733 cm－1為—COOH中的C O鍵伸縮振動的結(jié)果.在1 385 cm－1處為羧基—COO－中的C O對稱伸縮振動.1 063 cm－1的強吸收峰是酯內(nèi)的C—O—C反對稱伸縮振動吸收譜帶.879 cm－1為呋喃糖或羥基呋喃環(huán)的吸收峰，是由環(huán)和取代基的伸縮振動及次甲基的橫向振動所致.因此，可以判斷CBF中含有羧基，分別以—COO－和COOH的形式存在.此外，將絮凝劑溶液攤放在平板玻璃片上，使其干燥成膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，形成的薄膜韌性很強，從某種程度上表明絮凝劑的鏈型為線性.

圖5 紫外掃描圖譜

圖6 CBF的紅外光譜圖

3 結(jié)論

1)絮凝測定結(jié)果表明絮凝率達69%以上.其中4株絮凝率達80%以上，表明這6株絮凝菌具有很強的絮凝特性.

2)根據(jù)絮凝菌形態(tài)和生理生化特征鑒定及16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，Agrobacterium sp.與F2聚為一類，Bacillus sp.與絮凝菌F3、F4、F5、F6聚為一類，Kocuria sp.與絮凝菌F1聚為一類，序列同源性99%，但該6株絮凝菌尚不能定種，有待于進一步分析.

3)在菌群構(gòu)建中，F(xiàn)2和F6菌株按照1∶1比例混合培養(yǎng)發(fā)酵液絮凝率可達93.1%，這種組合的復合型生物絮凝劑絮凝率優(yōu)于各個單菌的絮凝率，也優(yōu)于其他雙菌組合.

4)在絮凝劑的成分分析中，紫外掃描圖譜分析絮凝劑中不含有蛋白質(zhì)和核酸，紅外光譜分析絮凝劑的有效成分為多糖類物質(zhì).

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