郜玉楠，李偉光－3，王廣智，張多英，劉 水

(1.哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，哈爾濱150090，gaoyunan01@163.com;2.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源開發(fā)利用(北方)國家工程研究中心，哈爾濱150090;3.哈爾濱工業(yè)大學水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱150090)

生物增強活性炭技術(bio-enhanced activated carbon，BEAC)是現(xiàn)代生物技術研究內容之一，其核心就是從自然界中篩選構建優(yōu)勢菌群，增強生物降解作用，保持生物活性炭工藝的長期穩(wěn)定性，提高對污染物的去除效率［1］.由于自然水體中生物相非常復雜，微生物的種類和數量較多，營養(yǎng)基質較少，從水體中篩選出的菌種活性很低，無法有效地降解污染物，且人工固定化活性炭上生物量較少，因此，進行菌群生物活性強化是有必要的.在飲用水處理中［2－4］，優(yōu)勢菌群生物活性的強化就是通過從富營養(yǎng)到貧營養(yǎng)，再從貧營養(yǎng)到富營養(yǎng)而后再到貧營養(yǎng)的變化過程，最終使篩選出的菌株能夠在微量有機物的水體中生長，提高菌種活性.微生物菌種生物活性的強化過程實際上是菌種的誘導變異過程，反復經過營養(yǎng)的變化，菌種具備了適應水質波動的貧營養(yǎng)環(huán)境，這樣菌種被固定到活性炭上后，才能夠保持旺盛的生物降解能力［5］.

本文研究培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)時間和氧含量因素對優(yōu)勢菌群脫氫酶活性的影響，從而確定優(yōu)勢菌群生物活性強化的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并在優(yōu)化條件下通過貧富營養(yǎng)交替的方式強化優(yōu)勢菌群的生物活性，以PCR－DGGE技術比較了優(yōu)化條件與未優(yōu)化條件下強化的優(yōu)勢菌群在活性炭上的生物量固定情況.

1 試驗

1.1 優(yōu)勢菌來源

從松花江水中篩選出5株具有降解有機物效果的菌種，經鑒定分別為Pseudomonas balearica，Pseudomonas putida，Acinetobacter calcoaceticus，Acinetobacter lwoffii，Brevibacterium mcbrellneri.

1.2 培養(yǎng)基

Ⅰ:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min;Ⅱ:蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

Ⅲ:葡萄糖 10 g，NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

Ⅳ:NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

Ⅴ:NaCl 5 g，松花江水砂濾出水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

1.3 試驗方法

優(yōu)勢菌群最優(yōu)培養(yǎng)條件確定:通過I號培養(yǎng)基，研究不同培養(yǎng)條件下，即培養(yǎng)溫度(13～38℃)、pH值(3～10)、培養(yǎng)時間(12～72 h)、溶解氧質量濃度(4～9 mg/L)，優(yōu)勢菌群脫氫酶活性的變化規(guī)律.

優(yōu)勢菌群生物活性強化試驗:在已確定的最佳生長條件下，利用不同濃度梯度營養(yǎng)成分的強化培養(yǎng)基(I、Ⅱ、III、Ⅳ、V)，對優(yōu)勢菌群進行反復強化，強化培養(yǎng)采用半連續(xù)馴化培養(yǎng)法，其過程為:將待用菌株的斜面用10 mL無菌水洗脫，然后各取2 mL菌液分別接種于裝有已滅菌的100 mL培養(yǎng)基I中，再置于搖床上.吸取菌株培養(yǎng)基I的培養(yǎng)液10 mL，分別加入盛有100 mL培養(yǎng)基Ⅱ的玻璃瓶中，置于搖床上培養(yǎng).依次按上述量和培養(yǎng)方法，將菌株的培養(yǎng)液分別加入培養(yǎng)基III、Ⅳ、V中，最后加入已經滅菌的水中［6］.

試驗重復進行3次，圖表中所得結果為3次實驗平均值.溶解氧參數變化控制采用加氧泵進行曝氣，試驗裝置如圖1所示.

圖1 優(yōu)勢菌群生物活性強化的溶解氧控制試驗裝置

1.4 檢測方法

生物活性檢測方法采用脫氫酶活性法，選用無色的氯化三苯基四氮唑(TTC)受氫后變成紅色的三苯甲基(TF)，然后利用比色法做定量分析［7－8］.取培養(yǎng)后的混合菌液10 mL，置于離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，底部菌體用無菌水洗脫倒入比色管，進行脫氫酶測定.

2 結果與討論

2.1 溫度對優(yōu)勢菌群脫氫酶活性的影響

研究不同溫度條件下優(yōu)勢菌群脫氫酶活性的變化，培養(yǎng)條件為pH值7.0，培養(yǎng)時間為24 h，DO值范圍為6～8 mg/L，結果如圖2所示.溫度是影響微生物活性的主要因素，不同菌種相應的最佳生長溫度也不同，在適宜的溫度下，活化分子數增多，反應速度加快，從而使微生物的降解速度加快.中溫菌所產生的酶一般要求較高反應溫度，在低溫條件下酶活性降低，而來自耐冷菌細胞中的酶必須適應低溫環(huán)境，它們的分子結構能夠在低溫下保持較高的穩(wěn)定性和催化活性［9］.試驗觀察優(yōu)勢菌群在培養(yǎng)溫度為18～23℃范圍脫氫酶活性較高，培養(yǎng)溫度低于13℃和高于33℃時，優(yōu)勢菌群脫氫酶活性較低，最佳溫度為18℃.

2.2 pH對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

微生物生長適宜pH值范圍較寬，不同微生物生長的最適pH值也有一定差別，并且各微生物生長的最適pH值與其分泌某種代謝產物的pH值通常是不同的，因此，確定優(yōu)勢菌群最適pH值范圍可以提高優(yōu)勢菌群的生物活性并在擴大培養(yǎng)中得到較高的菌量［10］.試驗研究pH值在3～10范圍內優(yōu)勢菌群脫氫酶活性的變化規(guī)律，培養(yǎng)條件為溫度23℃，培養(yǎng)時間為24 h，DO值范圍為6～8 mg/L，結果如圖3所示.pH值范圍在5～9時優(yōu)勢菌群脫氫酶活性較高，最適pH值為6，說明優(yōu)勢菌群在偏酸性條件下有較高的活性.

圖2 溫度對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

圖3 pH對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

2.3 培養(yǎng)時間對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

圖4為優(yōu)勢菌群隨培養(yǎng)時間變化的脫氫酶活性測定結果，培養(yǎng)條件為溫度23℃，pH值為7.0，DO值范圍為6～8 mg/L.0～24 h優(yōu)勢菌群生長處于遲緩期，生物活性較低.當微生物細胞適應環(huán)境后，24～36 h處于對數生長期，生物活性迅速升高.42～54 h內，微生物細胞進入穩(wěn)定期，生物活性變化不明顯，當培養(yǎng)60 h以后，由于環(huán)境中營養(yǎng)物質的不足，微生物進入生長的衰亡期，生物活性明顯降低，因此，最佳培養(yǎng)時間可確定為36 h.

2.4 溶解氧對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

由于試驗所選5株優(yōu)勢菌均為好氧性微生物，氧作為在呼吸作用中的最終電子受體和供不飽和脂肪酸等的合成，其對優(yōu)勢菌的生物活性有很大的影響［10］.圖5為優(yōu)勢菌群培養(yǎng)過程中氧質量濃度對脫氫酶活性的影響，培養(yǎng)條件為溫度23℃，pH值為7.0，培養(yǎng)時間為24 h.可以看出，當培養(yǎng)液中溶解氧含量小于7 mg/L時，優(yōu)勢菌群的脫氫酶活性隨溶解氧質量濃度增加而升高;當溶解氧含量大于7 mg/L時，優(yōu)勢菌群脫氫酶活性升高趨勢減緩，脫氫酶活性維持在40～45 mg/(L·h)，因此，可確定優(yōu)勢菌群最適生長溶解氧為7 mg/L.

圖4 培養(yǎng)時間對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

圖5 DO對優(yōu)勢菌群培養(yǎng)中脫氫酶活性的影響

2.5 優(yōu)勢菌群生物活性強化過程分析

圖6為兩種條件下優(yōu)勢菌群生物活性強化過程，其中優(yōu)化條件為溫度18℃，pH值為6，單一培養(yǎng)基培養(yǎng)時間為36 h，溶解氧質量濃度為6～7 mg/L.未優(yōu)化條件為溫度23℃，pH值為6，單一培養(yǎng)基培養(yǎng)時間為24 h，溶解氧質量濃度為6～7 mg/L.可以看出，兩種條件強化過程在初始階段優(yōu)勢菌群的生物活性均較低，從富營養(yǎng)化向貧營養(yǎng)化轉變的過程中，在較優(yōu)條件下生長的優(yōu)勢菌群生物活性首先有一定的增加，但是增加幅度不明顯，這說明菌種在馴化過程中出現(xiàn)一個適應過程，在這個適應過程中，雖然改變了培養(yǎng)基的類型，但是增強菌不能在短時間內適應這個變化，因而生物活性的增強受到了抑制.當馴化進行到貧營養(yǎng)的狀態(tài)時，即進入Ⅴ號培養(yǎng)基，增強菌的生物活性有所降低，這是由于培養(yǎng)基Ⅴ不含有微生物所需的營養(yǎng)物質，微生物的脫氫酶活動受到較大抑制.在第二階段由貧營養(yǎng)化向富營養(yǎng)化變化，從Ⅴ至Ⅲ的變化過程中，微生物活性迅速增加，這一階段微生物適應了營養(yǎng)水平的變化，微生物活性呈現(xiàn)出線性增加的狀態(tài)，在隨后的Ⅲ至Ⅰ的過程中，雖然營養(yǎng)物質水平增加了，但是生物活性增長幅度較小，因而可以認為馴化達到了終點，即使營養(yǎng)水平再變化也不會對微生物活性有較大改變.與優(yōu)化條件相比，未優(yōu)化條件下的優(yōu)勢菌群生長活性變化較慢，適應性較差.

圖6 優(yōu)勢菌群生物活性強化過程中脫氫酶活性的變化規(guī)律

2.6 優(yōu)勢菌固定活性炭上PCR－DGGE分析

試驗采用PCR－DGGE技術［11－12］比較兩種條件下強化生物活性后的優(yōu)勢菌群在活性炭上固定化的情況，測定得到的指紋圖譜見圖7.指紋圖譜中不同的陰影部分代表不同的菌種，而陰影帶的數目代表生物菌種的數目，每一條陰影都代表不同的生物菌種，而陰影的深淺可以定性地代表其所指征的菌種的數量.可以看出，泳道A圖代表優(yōu)化條件下生物活性強化的優(yōu)菌群固定化結果，泳道B代表未優(yōu)化條件下生勢物活性強化的優(yōu)勢菌群固定化結果.泳道A圖與B圖均有明顯的5個條帶，說明活性炭表面明顯呈現(xiàn)5株菌種，但優(yōu)勢菌的數量有所不同，泳道A圖5株優(yōu)勢菌的條帶陰影明顯比B圖5株優(yōu)勢菌的條帶陰影淺，說明生物活性較強的優(yōu)勢菌群固定在活性炭上的數量較多，有研究表明［13］微生物活性較高，其可分泌胞外多聚物的能力較強，這種粘性的胞外多聚物在細菌與載體間起到了生物粘合劑的作用，使細菌較為容易實現(xiàn)在載體表面的附著和固定.

圖7 PCR－DGGE分析結果

3 結論

1)優(yōu)勢菌群在pH=6、溫度18℃、培養(yǎng)時間36 h、溶解氧7 mg/L條件下進行生物活性強化可以得到較高的脫氫酶活性.

2)根據PCR－DGGE分析結果，在優(yōu)化條件下強化所得到高活性優(yōu)勢菌群在活性炭上固定的數量明顯高于未在優(yōu)化條件下生長的優(yōu)勢菌群.

［1］ 楊基先，馬放，趙慶良，等.固定化生物活性炭除微量有機物的應用研究［J］.東北師范大學學報(自然科學版)，2002，32(1):91－95.

［2］ XIANDA Z，ROBERT F H，THOMAS C V.Longterm evaluation of adsorption capacity in a biological activated carbon fluidized bed reactor system［J］.Wat Res，1999，33(13):2983－2991.

［3］ BOON N，TOP E M，VERSTRAETE W，et al.Bioaugmentation as a tool to protect the structure and function of an activated sludge microbial community against a 3－chloroaniline shock load［J］.Appl Environ Microbiol，2003，6(9):1511－1520.

［4］ SILVA E，F(xiàn)IALHO A M，SA－CORREIA I，et al.Combined bioaugmentation and biostimulation to clean up soil contaminated with high concentrations of atrazine［J］.Environ Sci Technol，2004，38(2):632－637.

［5］ NARASIMMALU R，OSAMU M，NORIFUMI I，et al.Variation in microbial biomass and community structure in sediments of eutrophicbays as determined by phospholipid ester linked fatty acids［J］.Applied and Environment Microbial，1992，58(2):562－571.

［6］ 安東.活性炭組合工藝除污染特性及機理［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學，2005:103－104.

［7］ KOLMERT A，HENRYSSON T.Optimization of sulphide production in an anaerobic continuous biofilm process with sulphate reducing bacteria［J］.Biotechnology Letters，1997，17(10):971－975.

［8］ 周春生，尹軍.TTC－脫氫酶活性檢測方法的研究［J］.環(huán)境科學學報，1996，16(4):400－405.

［9］ 劉雨，趙慶良，鄭興燦.生物膜法污水處理技術［M］.北京:中國建筑工業(yè)出版社，2003:22－23.

［10］ 任南琪，馬放.污染控制微生物學［M］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社，2002:129－132.

［11］ ZHOU J，BRUNS M A，TIEDJE J M.DNA recovery from soils of diverse composition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(2):316－322.

［12］ 馬悅欣，HOLMSTROM C，WEBB J，等.變性梯度凝膠電泳(DGGE)在微生物生態(tài)學中的應用［J］.生態(tài)學報，2003.23(8):1562－1568.

［13］ LAZAROVA V，MANEM J.Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment［J］.Wat Res，1995，29(10):2227－2244.