羅登林，袁海麗，曾小宇，劉建學(xué)

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

響應(yīng)面法優(yōu)化Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶工藝的研究

羅登林，袁海麗，曾小宇，劉建學(xué)

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

為提高Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的產(chǎn)率，運用Plackett-Burmen方法對麩皮、菊粉、蛋白胨、酵母膏添加量和發(fā)酵時間、溫度、pH值、接種量8個影響因素進(jìn)行考察，篩選出麩皮添加量、發(fā)酵時間和pH值為3個顯著影響因素，然后采用Box-Behnken中心組合和響應(yīng)面法對上述3個因素進(jìn)行產(chǎn)酶條件的進(jìn)一步優(yōu)化，建立菊粉酶產(chǎn)率的二次多項式數(shù)學(xué)模型，并分析模型的有效性與因子間的交互作用。結(jié)果表明：黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶的優(yōu)化工藝參數(shù)為：麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時間81.5h、pH6.0。在此條件下，產(chǎn)酶活力達(dá)20.42U/mL，與優(yōu)化前相比提高了30.81%。

菊粉酶；Aspergillus niger X-6；發(fā)酵；響應(yīng)面法

菊粉酶(inulinase)，學(xué)名β-2,1-D-果聚糖酶，是一類能夠水解菊粉的酶的總稱[1]。利用菊粉酶水解菊粉可生產(chǎn)功能性低聚果糖和超高果糖漿，它們具有低熱量、抗齲性、調(diào)控血糖等多種生理功能；同時該方法生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)物得率高[2-6]。在上世紀(jì)70年代初，國外就開始選育高產(chǎn)菊粉酶的微生物來水解菊粉生產(chǎn)超高果糖漿，目前相關(guān)核心技術(shù)被比利時RAFTI和WARCOING及荷蘭COSUN三家公司所壟斷[7-8]。我國對菊粉酶的研究起于上世紀(jì)90年代，由于重視程度不夠，相關(guān)研究進(jìn)展比較緩慢[9-10]。近年來隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，以及我國有著廣泛種植可用于生產(chǎn)菊粉的原料——菊芋(俗名洋姜)的優(yōu)勢，因此，關(guān)于如何提高菊粉酶產(chǎn)率的研究正日益受到人們的重視。

本實驗以從菊芋生長的根際土壤中經(jīng)過初篩、分離純化、復(fù)篩和微波誘變后得到的一株Aspergillus niger X-6為菌種，運用Plackett-Burmen方法對影響產(chǎn)菊粉酶的因素進(jìn)行分析，然后采用Box-Behnken中心組合和響

應(yīng)面法對相關(guān)顯著因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，以期獲得Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的優(yōu)化工藝，提高菊粉酶的產(chǎn)率。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman design

1 材料與方法

1.1 菌種

從菊芋生長的根際土壤中經(jīng)過初篩、分離純化和復(fù)篩后，鑒定為Aspergillus niger，然后對復(fù)篩所得的菌株進(jìn)行微波誘變，得到一株高產(chǎn)菊粉酶的菌株，定義為Aspergillus niger X-6。

1.2 菊粉

粗制菊粉，用于培養(yǎng)基的配制；精制菊粉(菊粉含量＞92%，用于測酶活力的底物)由昆山拓豐貿(mào)易有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.3 粗制菊粉的制備

用超聲波輔助水溶液提取菊粉，具體工藝參數(shù)為：總提取時間10min、超聲輻照方式15s/6s、超聲功率750W、超聲頻率20kHz、料液比1:30.15、提取溫度40℃，然后對所得提取液依次進(jìn)行抽濾、真空濃縮、熱風(fēng)干燥(50℃)和粉碎，得到粗制菊粉(含水量5.63%)。

1.4 培養(yǎng)基

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、蛋白胨4%、粗制菊粉2%、酵母膏0.4%、NaCl 0.5%、K2HPO4· 3H2O 0.3%，初始pH6.5，接種量5%。

1.5 菊粉酶活力的測定

取0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入4mL、2%的精制菊粉溶液(0.1mol/L、pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)中，54℃保溫10min，沸水浴10min滅活終止反應(yīng)(在完全相同的條件下滅活酶底物對照)，快速冷卻后，測定還原糖產(chǎn)量[11-12]。菊粉酶活力定義為在上述條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖的酶量為1個菊粉酶活力單位(μmol/ (min·mL))。

1.6 Plackett-Burmen試驗

選用N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，對麩皮添加量、粗制菊粉添加量、蛋白胨添加量、酵母膏添加量、發(fā)酵時間、溫度、p H值、接種量8個影響菊粉酶活力的相關(guān)因素進(jìn)行研究[13]。每個因素取兩個水平：低水平“-1”和高水平“1”，“1”為“-1”的1.5～2倍，另設(shè)兩個空白項對應(yīng)表中的X3和X9，以考察試驗誤差。評價指標(biāo)為菌株發(fā)酵后的酶活力(U/mL)。 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平及編碼見表1。

1.7 顯著因素的中心點試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，確定麩皮添加量、發(fā)酵時間、起始pH值為影響評價指標(biāo)的顯著因素。分別對這3個因素進(jìn)行單因素試驗，獲得每個因素的最佳產(chǎn)酶水平。

1.8 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Plackett-Burman試驗和單因素試驗結(jié)果，選取麩皮添加量(X1)、發(fā)酵時間(X2)和初始pH值(X3)3個因素與菌株發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶活力進(jìn)行響應(yīng)面試驗。采用Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計并運用SAS9.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)工藝參數(shù)并進(jìn)行驗證。Box-Benhnken試驗設(shè)計因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Benhnken試驗因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design layout and experimental results

Plackett-Burman試驗結(jié)果見表3，表中1～12分別

代表12組實驗，按照設(shè)計好的方案進(jìn)行發(fā)酵實驗并最終測得其菊粉酶活力，每組試驗重復(fù)3次。運用SAS9.0統(tǒng)計軟件對表3進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表4。

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 Variance analysis for Plackett-Burman experimental results

采用SAS軟件對表3的酶活力數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，得到酶活力為響應(yīng)值的最優(yōu)多元次回歸方程：

Y=9.220833-1.165833X1-0.444167X2+0.495833X3+ 0.5975X4+1.080833X5+0.3625X6-0.559167X7+2.620833X8-0.1075X9-0.300833X10

由表4方差分析結(jié)果表明，所得的回歸方程達(dá)到顯著(P=0.038172)，決定系數(shù)R2=0.9998，說明99.98%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型來解釋。在試驗設(shè)計的水平范圍內(nèi)X1、X5和X8對菊粉酶活力均有顯著影響(P＜0.05)，它們對菊粉酶活力的影響水平可以達(dá)到98%左右，其他因素在所考察的水平范圍內(nèi)對酶活力的影響不顯著。因此，對黑曲霉X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶最主要的影響因子為麩皮添加量(X1)、發(fā)酵時間(X5)和初始pH值(X8)，選取他們?yōu)檠芯繉ο?，作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

麩皮添加量、發(fā)酵時間、pH值的單因素試驗結(jié)果表明，選擇麩皮添加量4%、發(fā)酵時間84h、pH6.0作為試驗的中心點。采用Box-Behnken試驗設(shè)計對3個顯著因素進(jìn)行優(yōu)化試驗。根據(jù)表2的因素和水平，以X1、X2、X3為自變量，將影響不顯著的因素固定在上述試驗中的低水平，以最終測得的酶活力為響應(yīng)值(Y)，試驗方案及結(jié)果見表5。表5中1～15分別代表15組實驗，其中13～15為中心點試驗，重復(fù)3次，用以估計實驗誤差。

表5 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Box-Benhnken design layout and experimental results

通過SAS9.0統(tǒng)計軟件對表5的試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菊粉酶活力(Y)對自變量麩皮添加量X1、發(fā)酵時間X2、初始pH值X3的二次多項回歸模型方程如下：

Y=20.08333+0.4475X1-0.63875X2+1.63125X3-0.355417X12-0.195X1X2-0.295X1X3-2.137917X22-0.8775X2X3-6.957917X32

表6 方差分析表Table 6 Variance analysis for Box-Benhnken experimental results

由表6可知，方程失擬項不顯著(P=0.100318＞0.05)，說明方程不失擬。方程模型極顯著(P=0.0001＜0.01)，說明方程能夠很好的擬和試驗結(jié)果。同時，軟件分析得到模型的決定系數(shù)R2=0.9962，說明菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶活力所考察的3個因素中，僅有0.38%試驗數(shù)據(jù)

的變異性不能由該模型來解釋，表明該模型能夠很好地反映試驗的真實情況。由二次多項回歸模型方程得知，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯，回歸方程的一次項、二次項的均方差和系數(shù)都較大，而交互項系數(shù)較小，說明響應(yīng)面分析所選的3個因素之間的交互效應(yīng)較小。從方差分析表還可以看出，方程的一次項極顯著，其中X1項顯著，X2、X3項極顯著；方程的二次項X22、X32項極顯著；方程的交互項顯著，其中X2X3項極顯著，說明發(fā)酵時間(X2)與初始pH值(X3)對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有明顯的交互作用。

2.2.2 最優(yōu)響應(yīng)值分析

運用SAS9.0軟件對回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)區(qū)。回歸模型存在穩(wěn)定點，Y的最大估計值為20.38，穩(wěn)定點(X1，X2，X3)為(0.63671，-0.20233，0.011648)。這說明：X1(麩皮添加量)的最佳范圍在4.64%左右，X2(發(fā)酵時間)的最佳范圍在81.57h左右，X3(pH值)的最佳范圍在6.01左右。

2.2.3 驗證實驗

根據(jù)響應(yīng)面分析得到菌種發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝參數(shù)為：麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時間81.57h、起始pH6.01。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá)20.38U/mL。為了驗證響應(yīng)面分析的可靠性，結(jié)合實際試驗條件，選定麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時間81.5h、初始pH6.0，其他不顯著因子條件不變，進(jìn)行驗證實驗，經(jīng)過3次平行試驗，測得菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶實際酶活力的平均值為20.42U/mL，與理論預(yù)測值20.38U/mL接近，相對誤差為0.196%，說明該回歸模型預(yù)測準(zhǔn)確性很高。

3 結(jié) 論

利用P la ck e tt-B u r man試驗設(shè)計，考察影響Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的8個相關(guān)因素，包括：麩皮添加量、菊粉添加量、蛋白胨添加量、酵母膏添加量、發(fā)酵時間、溫度、初始pH值和接種量，從中篩選出麩皮添加量、發(fā)酵時間、pH值3個對菌種發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因素(P＜0.05)。

在Plackett-Burman試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗設(shè)計，對麩皮添加量、發(fā)酵時間、初始pH值3個顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了菊粉酶產(chǎn)率的二次多項式數(shù)學(xué)模型，分析了模型的有效性與因子間的交互作用，得到了Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的優(yōu)化工藝參數(shù)為：麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時間81.5h、pH6.0。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá)20.42U/mL，與優(yōu)化前相比提高了30.81%。

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Optimization of Lnulinase Fermentation by Aspergillus niger X-6 Using Response Surface Methodology

LUO Deng-lin，YUAN Hai-li，ZENG Xiao-yu，LIU Jian-xue
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The objective of this study was to obtain the optimum conditions for Aspergillus niger X-6 fermentation to improve inulinase yield. The effects of the amounts of wheat bran, inulin, peptone and yeast extract in the fermentation medium, fermentation time and temperature, pH, and inoculum size on inulinase yield were evaluated using Plackett-Burmen design. Inulinase yield was significantly influenced by the amount of wheat bran addition, fermentation time and pH. Subsequently, the optimization of the three factors was conducted using Box-Behnken experimental design and response surface methodology, in which, a quadratic polynomial model for inulinase yield was established. The optimal fermentation conditions for inulinase prodtion were determined to be: the amount of wheat bran addition, 4.64%; fermentation time, 81.5 h; and initial mdedim pH 6.0. Under these conditions, the yield of inulinase reached 20.42 U/mL, 30.81% higher than that before optimization.

inulinase；Aspergillus niger X-6；fermentation；response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0138-04

2010-03-30

河南省教育廳科技攻關(guān)項目(2008B550002)；河南科技大學(xué)SRTP項目(154)

羅登林(1976—)，男，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品深加工及生物化工技術(shù)。E-mail：luodenglin@sohu.com