史西志，楊 華，孫愛(ài)麗，李德祥，陳 炯

(1.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

氯霉素分子印跡聚合物微球的制備及色譜性能評(píng)價(jià)

史西志1，楊 華2，孫愛(ài)麗1，李德祥1，陳 炯1

(1.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

以氯霉素(CAP)為模板分子、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(DEAEM)為功能單體、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)為交聯(lián)劑、聚苯乙烯微球作為種球，采用兩步溶脹聚合的方法制備得到了粒徑均一的分子印跡聚合物微球(MIPMs)。結(jié)果表明：掃描電鏡觀(guān)察顯示其表面為多孔結(jié)構(gòu)；通過(guò)孔容和孔徑研究表明，與非印跡聚合物微球(NIPMs)相比，MIPMs具有更大的孔徑和孔體積；進(jìn)一步通過(guò)液相色譜對(duì)其選擇性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，可知氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素在MeCN/Water/H3PO4(30:70:0.1，V/V)流動(dòng)相條件下，3種物質(zhì)達(dá)到了較好的分離效果，獲得的MIPMs對(duì)3種物質(zhì)具有較好的選擇性能。

氯霉素；分子印跡微球；甲砜霉素；氟甲砜霉素

氯霉素(chloramphenicol，CAP)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌均具有抑制作用，主要用于治療各種細(xì)菌感染，但是由于其具有嚴(yán)重的毒副作用，如導(dǎo)致骨髓抑制(bone marrow depression)、再生障礙性貧血(aplastic anemia)、先天性發(fā)育不全(hypoplastic anemia)等[1]。因此，已被許多國(guó)家如中國(guó)、歐盟和美國(guó)等禁止在動(dòng)物性食品中使用，并立法規(guī)定了最高殘留限量[2]。目前，關(guān)于氯霉素的檢測(cè)方法，主要有酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)[3]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[4]、氣相色譜(gas chromatography，GC)[5]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatographic-tandem mass spectrometri，LCMS/MS)[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS)[7]等，各種檢測(cè)方法均需要高效的分離、純化過(guò)程。分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是人工合成的對(duì)

某一或某類(lèi)分子(模板分子及其類(lèi)似物)具有特定選擇性的聚合物，已成功應(yīng)用于氯霉素等各類(lèi)抗生素的分離純化[8]。但是，目前，制備MIPs的方法主要是本體聚合法(bulk-polymerization)，該方法雖然制備簡(jiǎn)單，但是后續(xù)處理過(guò)程復(fù)雜，如需要經(jīng)過(guò)研磨、篩分才能得到合適大小的粒子，得率較低[9]；因此，為了克服本體聚合方法的缺點(diǎn)，近年來(lái)，制備形狀規(guī)則、粒徑均一的MIPs的方法得到了快速發(fā)展，如懸浮聚合、多步溶脹聚合和沉淀聚合等[10]。本實(shí)驗(yàn)擬利用兩步溶脹聚合的方法制備氯霉素特異的分子印跡聚合物微球(molecularly imprinted polymer microspheres，MIPMs)，并對(duì)其表面形態(tài)、孔容、孔徑及選擇性等性能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟甲砜霉素(FF)德國(guó)Sigma公司；甲基丙烯酸、N,N-二乙基氨基乙酯(DEAEM) Sigma-Aldrich公司；二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、苯乙烯 Fluka公司；甲醇、乙腈(色譜純) TEDIA公司；偶氮二異丁腈(AIBN)、氯仿、十二烷基硫酸鈉、過(guò)硫酸鉀、鄰苯二甲酸酯等(分析純)國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；聚乙烯醇1788 上海石油化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10Avp高效液相色譜系統(tǒng)、Venusil XBP C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱 日本島津公司；SIRION 200場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司；BELSORP-mini IIINC測(cè)量設(shè)備 BEL公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 分子印跡微球的制備

MIPMs的制備主要參照J(rèn)avanbakht等[11]報(bào)道的方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，其制備方法如下。

1.3.1.1 聚苯乙烯種球的制備

將15mL 苯乙烯、100mg 過(guò)硫酸鉀加入到150mL 水中，置于四口瓶中，然后超聲波處理10min，通入氮?dú)?min，70℃，270r/min反應(yīng)24h，反應(yīng)過(guò)程中持續(xù)通入氮?dú)?。反?yīng)結(jié)束后，5000r/min離心收集種球，然后加入適量水，使種球與水配比為100mg/mL。

1.3.1.2 微球的制備

溶液Ⅰ：0.96mL鄰苯二甲酸酯、0.02g十二烷基硫酸鈉、10mL水，超聲30min，然后加入1mL水分散聚苯乙烯種球，超聲20min，室溫，125r/min振蕩，直到顯微鏡下油滴完全消失；溶液Ⅱ：0.3g AIBN，5mL氯仿，12.5mL水，10mL 4.8%聚乙烯醇1788，超聲混合20min，125r/min室溫振蕩2h，使其分散均勻；溶液Ⅲ：12.5mL水，10mL 4.8%聚乙烯醇1788，0.32g CAP，0.8mL DEAEM，5mL EGDMA，0.02g十二烷基硫酸鈉，2mL四氫呋喃，超聲混合20min，125r/min室溫2h。

將溶液Ⅰ、Ⅱ加入到溶液Ⅲ中，50℃氮?dú)鈼l件下反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后，將微球置于200mL沸水中10min，5000r/min離心收集，然后將聚合物微球用甲醇-甲酸(V/V，90:10)索氏萃取24h，然后用甲醇萃取2h，最后將得到的聚合物微球50℃真空干燥6h至質(zhì)量恒定。

對(duì)照聚合物微球(non-imprinted polymer microspheres，NIPMs)的制備除不加入CAP外，其他反應(yīng)條件同MIPMs。

1.3.2 孔容和孔徑分析

精確稱(chēng)取0.1000g聚合物，70℃脫氣4h后，采用BELSORP-mini比表面積和孔徑測(cè)定儀，通過(guò)BET (Brunauer-Emmett-Teller)法測(cè)定比表面積，T-plot和MP法測(cè)定微孔容積和直徑，BJH法測(cè)定中孔分布[12]。

1.3.3 分子印跡色譜柱的裝填及色譜評(píng)價(jià)

稱(chēng)取2.5g聚合物于30mL異丙醇中，超聲勻漿10min后，在20MPa壓力下，以乙腈作為頂替液，濕法裝柱(150mm×4.6mm)，以乙腈為流動(dòng)相，直到獲得穩(wěn)定的基線(xiàn)。

甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)為226、223、278nm，進(jìn)樣體積為20μL。實(shí)驗(yàn)中，用丙酮測(cè)定死時(shí)間，保留因子k=(t－t0)/t0，其中，t為分析物的保留時(shí)間，t0為死時(shí)間。印跡因子IF=kMIP/ kNIP，其中，kMIP為分析物在分子印跡聚合物微球色譜柱上的保留因子，kNIP為分析物在對(duì)照聚合物微球色譜柱上的保留因子。選擇因子α＝k1/k2，其中，k1為氯霉素的保留因子，k2為甲砜霉素和氟甲砜霉素的保留因子。保留指數(shù)RI＝αNIP/αMIP[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微球的形態(tài)觀(guān)察

圖1 氯霉素分子印跡聚合物微球的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of CAP MIPMs and NIPMs

MIPMs的制備過(guò)程中，分散劑作為一種在分子內(nèi)同時(shí)具有親油性和親水性的界面活性劑，在微球的形成過(guò)程中起著重要的作用，本研究采用PVA1788 作為分散劑，以氯仿為致孔劑、采用兩步溶脹聚合的方法制備得到分子印跡聚合物微球，采用掃描電鏡對(duì)獲得的MIPMs和NIPMs的表面形態(tài)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察，如圖1所示，獲得的MIPMs平均粒徑為4μm，且粒徑比較均一，同時(shí)，可看到其表面呈多孔結(jié)構(gòu)。

2.2 孔容及孔徑分析

由圖1可以看出，MIPMs和NIPMs粒徑均一，表面都呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，因此，為更好的了解MIPMs的識(shí)別機(jī)理，采用氮?dú)馕?解吸附實(shí)驗(yàn)分析MIPMs和NIPMs的比表面積、孔體積和孔徑，分析結(jié)果見(jiàn)表1，MIPMs與NIPMs相比，比表面積基本相同，但是，由于分子印跡效應(yīng)的存在，從而導(dǎo)致MIPMs與NIPMs在孔體積和孔徑上存在明顯差異，MIPMs的孔體積和孔徑均大于NIPMs，為模板分子及類(lèi)似物與MIPMs的選擇性識(shí)別提供了互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)。

表1 氯霉素MIPMs和NIPMs的孔結(jié)構(gòu)特征Table 1 Pore structural characteristics of CAP MIPMs and NIPMs

2.3 選擇性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)分子印跡作用的原理，通常合成的聚合物對(duì)某一或某一類(lèi)物質(zhì)具有特異選擇性，為更好地了解獲得的MIPMs的選擇性和色譜性能，通過(guò)色譜法研究MIPMs對(duì)CAP及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物TAP和FF的分離效果，結(jié)果如圖2所示。流動(dòng)相為MeCN-水(30:70，V/V)時(shí)，MIPMs相對(duì)于NIPMs(圖2A、2C)，對(duì)CAP、TAP和FF表現(xiàn)出更好的色譜分離效果，但是三者未實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離；而在流動(dòng)相為MeCN-水-H3PO4(30:70:0.1，V/V)條件下，由圖2B、D可以看到，與NIPMs相比，F(xiàn)F、CAP和TAP三種物質(zhì)在MIPMs色譜柱中得到了更好的分離效果，表明獲得的MIPMs成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAP的印跡和識(shí)別。

進(jìn)一步通過(guò)色譜分析得到CAP、FF和TAP(圖3)的保留因子(k)、印跡因子(IF)、分離因子(α)和保留指數(shù)(RI)，對(duì)MIPMs的選擇性能和色譜行為進(jìn)行深入研究，其結(jié)果見(jiàn)表2。在流動(dòng)相為MeCN-水(30:70，V/V)色譜條件下，MIPMs對(duì)CAP表現(xiàn)出了最大的k及IF，對(duì)FF、TAP的IF、α和RI依次減?。欢遗cNIPMs相比，MIPMs對(duì)CAP、FF和TAP都獲得了更大的k，表明獲得的MIPMs對(duì)CAP具有最好的保留能力(k)和印跡效果(IF)[13]。從CAP、FF和TAP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖3所示，CAP與TAP、FF相比，其－NO2基團(tuán)被－SO2CH3代替，CAP與TAP都具有兩個(gè)－OH，F(xiàn)F僅有一個(gè)－OH，另一個(gè)－OH被－F代替，表明空間效應(yīng)在MIPMs的特異性識(shí)別中起到重要作用。進(jìn)一步根據(jù)模板分子結(jié)構(gòu)和功能單體的性質(zhì)，MIPs的色譜性能與流動(dòng)相的酸堿性有關(guān)[14]，由表2可以看出，在流動(dòng)相MeCN-水-H3PO4(30:70:0.1，V/V)條件下，MIPMs對(duì)FF和TAP具有相似的IF和RI，表明MIPMs對(duì)FF和TAP

具有相似的印跡效果和識(shí)別選擇性[12]，但是由于空間效應(yīng)的存在，MIPMs對(duì)FF表現(xiàn)出更強(qiáng)的保留能力(k)；與流動(dòng)相為MeCN-水(30:70，V/V)條件下相比，MIPMs對(duì)TAP表現(xiàn)出更好的IF和RI，而對(duì)FF的IF和RI則降低，因此可以得出，TAP的－OH基團(tuán)在分子識(shí)別過(guò)程中起到非常重要的作用，表明離子鍵和氫鍵在MIPMs的識(shí)別過(guò)程中具有重要作用[14]。同時(shí)由于流動(dòng)相為乙腈和水的混合溶液，而在水相溶液中，MIPs對(duì)模板分子及其類(lèi)似物的識(shí)別主要有特異性和非特異性?xún)煞N識(shí)別方式，其中，特異性識(shí)別主要來(lái)源于印跡過(guò)程，如氫鍵、離子鍵和空間效應(yīng)等，而非特異性識(shí)別，如疏水作用力在印跡識(shí)別中起到非常重要的作用[15]。因此可以得出，MIPMs與目標(biāo)物質(zhì)之間的選擇性相互作用是空間效應(yīng)、氫鍵和離子相互作用、疏水相互作用協(xié)同作用的結(jié)果，從而對(duì)CAP表現(xiàn)出了最大的保留能力。

圖3 CAP、FF和TAP的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structure of CAP, FF and TAP

表2 pH值對(duì)氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素在MIPMs和NIPMs中 k, IF, α和RI的影響Table 2 Effect of different pH values on k, IF, αand RI of CAP, TAP and FF adsorption on CAP MIPMs and NIPMs

3 討 論

3.1 以CAP為模板分子，以聚苯乙烯微球作為種球，通過(guò)兩步溶脹聚合的方法合成了粒徑大小均一的MIPMs，對(duì)CAP、FF和TAP三種物質(zhì)表現(xiàn)出良好分離性能。

3.2 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，獲得的MIPMs作為液相色譜固定相出現(xiàn)色譜峰過(guò)寬和拖尾現(xiàn)象，主要原因是由于獲得的分子印跡聚合物結(jié)合位點(diǎn)的非均一性所致[16]；總之，盡管MIPs用于色譜填料對(duì)CAP、FF和TAP的分離檢測(cè)還存在一定的問(wèn)題，但與常規(guī)液相色譜填料相比，由于分子印跡聚合物具有特定的識(shí)別能力及良好的理化特性，隨著分子印跡技術(shù)理論及制備技術(shù)的成熟，分子印跡技術(shù)在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將更加廣泛。

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Preparation and Chromatographic Evaluation of Molecularly Imprinted Polymer Microspheres for Chloramphenicol

SHI Xi-zhi1，YANG Hua2，SUN Ai-li1，LI De-xiang1，CHEN Jiong1
(1. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

A uniformly sized molecularly imprinted polymer microspheres (MIPMs) for chloramphenicol (CAP) has been prepared by a two-step swelling and polymerization method using 2-(Diethylamino) ethyl methacrylate (DEAEM), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) and polystyrene microspheres as the functional monomer, cross-linker and seed particles, respectively. The porous surface of MIPMs could be clearly observed under scanning electron microscope (SEM). Furthermore, the MIPMs had a larger pore volume and pore diameter measured using BELSORP-miniII than the non-imprinted polymer microspheres (NIPMs) did. The selectivity of MIPMs was assessed by chromatographic method, and CAP, thiamphenicol (TAP) and florfenicol (FF) could reach a stronger separation on the MIPMs with a MeCN/water/H3PO4mixture (30:70:0.1, V/V) as the mobile phase.

chloramphenicol；molecularly imprinted polymer microspheres；thiamphenicol；florfenicol

O652.63

A

1002-6630(2010)18-0095-04

2010-05-18

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009A610146)；浙江省教育廳高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(Y200803423)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z438)

史西志(1979—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锇踩?。E-mail：sxzsa178@yahoo.com.cn