黃冬梅，史永富，王 媛，蔡友瓊*

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090)

HPLC-MS/MS測(cè)定水產(chǎn)品中苯丙酸諾龍、諾龍殘留量

黃冬梅，史永富，王 媛，蔡友瓊*

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090)

建立水產(chǎn)品中苯丙酸諾龍、諾龍殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。樣品用混合溶劑提取，提取液經(jīng)濃縮溶解后采用液液萃取和C18柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果表明：苯丙酸諾龍、諾龍?jiān)?.005～0.25μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在3個(gè)濃度添加水平下，兩者的回收率分別為84.2%～91.3%、76.8%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.8%～13.6%、 3.3%～11.3%，最低檢測(cè)限為5.0μg/kg。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；苯丙酸諾龍；殘留量；水產(chǎn)品

苯丙酸諾龍是一種蛋白同化激素，是由雄激素衍生出的人工合成類(lèi)固醇化合物。在醫(yī)學(xué)上用于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷后的修復(fù)，再生障礙性貧血的治療及骨質(zhì)疏松癥的輔助治療等。在水產(chǎn)行業(yè)中被添加在飼料中，利用其強(qiáng)的蛋白同化作用，增強(qiáng)食欲和提高飼料轉(zhuǎn)化率。但長(zhǎng)期使用苯丙酸諾龍會(huì)造成男女性別特征的紊亂、總膽固醇升高、肝細(xì)胞癌青少年兒童骨骼早閉后的身材矮小等[1]。因此農(nóng)業(yè)部公告禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄中將其作為蛋白同化激素被禁止使用，不得在動(dòng)物性食品中檢出，農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告附錄3指出苯丙酸諾龍的代謝物為諾龍。

目前已有的苯丙酸諾龍及諾龍的殘留檢測(cè)方法有氣質(zhì)聯(lián)用法[2-9]、液相色譜法[10-11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12-15]等。目前較為常用的是氣質(zhì)聯(lián)用法，但此法需要硅烷化衍生后才能上機(jī)，而硅烷化產(chǎn)物不穩(wěn)定，影響測(cè)定結(jié)果，因此采用液質(zhì)法可以省卻該步驟，操作更簡(jiǎn)便。水產(chǎn)品本底基質(zhì)復(fù)雜，蛋白、酯肪含量高，干擾目標(biāo)化合物的定性定量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)樣品前處理步驟的研究比較，建立能有效去除干擾物質(zhì)的處理方法，同時(shí)利用液相色譜質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對(duì)苯丙酸諾龍、諾龍質(zhì)譜行為進(jìn)行解析，確定特征離子和離子對(duì)比例，明確定性定量方法，建立高效、簡(jiǎn)便、高靈敏度的水產(chǎn)品中苯丙酸諾龍、諾龍的殘留檢測(cè)法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產(chǎn)品購(gòu)自上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，草魚(yú)每條質(zhì)量約1kg，取一條去鱗、去皮，沿脊背取肌肉，南美白對(duì)蝦每只體質(zhì)量約20g，取500g，去頭、去殼，取肌肉部分。絞碎并使之均勻。

苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)生物制品檢定中心；諾龍標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr公司；甲醇、正己烷、石油醚、乙酸乙酯(色譜純) Supelco公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；0.2mol/L乙酸鈉溶液、β-葡糖苷酸酶(94400U/mL)、正己烷-石油醚-叔丁基甲基醚混合提取液(1:1:1，V/V)；正己烷-乙酸乙酯溶液(85:15，V/V)、甲醇-0.1%甲酸溶液(75:25，V/V)。

準(zhǔn)確稱取苯丙酸諾龍、諾龍標(biāo)準(zhǔn)品各0.005g，用甲醇分別溶解，定容至50mL容量瓶中，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧串聯(lián)四極桿ESI和APCI) 美國(guó)Thermo公司；TD5A-WS型離心機(jī) 湘儀離心機(jī)廠；N-EVAPTM111型氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；GINIUS3型均質(zhì)器 IKA公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。1.3測(cè)定條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18(100mm×2.5mm，2.5μm)。條件：柱溫25℃，柱流速0.25mL/min，進(jìn)樣量25μL。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫程序Table1 Mobile phase and gradient elution program

1.3.2 質(zhì)譜條件

表2 定性、定量離子對(duì)及碰撞能量Table2 Qualitative and quantitative ions and collision energy for nandrolone and nandrolone phenylpropionate

離子化模式：電噴霧ESI離子源正模式，噴霧電壓：4500V，鞘氣流量：10.0mL/min，輔助氣流量：1.7mL/min，毛細(xì)管溫度：320℃，碰撞氣：氬氣，掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式。以豐度最大的二級(jí)碎片離子作為定量離子，次強(qiáng)碎片離子作為定性離子。苯丙酸諾龍及諾龍的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞能量見(jiàn)表2。

1.4 分析步驟

1.4.1 提取

稱取試樣(2±0.05)g于50mL離心管中，加0.2mol/L乙酸鈉溶液12mL及β-葡糖苷酸酶50μL，混勻，40℃水浴16h，冷卻至室溫，用1.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.0，加混合提取液20mL，振蕩5min，超聲15min，10000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)入雞心瓶中，殘?jiān)尤?0mL混合提取液重復(fù)操作一次，合并提取液于35℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

1.4.2 凈化

用15mL甲醇分3次洗雞心瓶中提取物，將甲醇溶液轉(zhuǎn)至100mL離心管中，在離心管中加水15mL和混合提取液30mL，振蕩5min，4000r/min 離心10min，上清液轉(zhuǎn)入另一雞心瓶中，在離心管中再加混合提取液30mL，重復(fù)操作一次，合并上清液于35℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加1mL 甲醇溶解殘留物，加入9mL水混勻，備用過(guò)柱。固相萃取柱先依次用甲醇5mL、水5mL預(yù)洗，將上述樣品溶液過(guò)柱，用5mL水淋洗，固相萃取柱用真空抽干，用乙酸乙酯5mL和正己烷-乙酸乙酯溶液5mL洗脫，洗脫液于40℃氮?dú)獯蹈?，用甲?甲酸溶液2.0mL溶解殘留物，用0.22μm濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析用。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

根據(jù)苯丙酸諾龍、諾龍的化學(xué)性質(zhì)，屬于脂溶性物質(zhì)，可溶于乙醇、甲醇、正己烷等有機(jī)溶劑，難溶于水。在實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果直接用有機(jī)溶劑提取會(huì)使樣品分散不均勻，有機(jī)溶劑較難完全滲透到肌肉組織中，而在酶解后的水溶液中，用有機(jī)溶劑提取，能使提取完全。

2.2 凈化方法的確定

通常水產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)的凈化方法多采用固相萃取柱凈化法和液-液萃取凈化法。目前已有的苯丙酸諾龍、諾龍檢測(cè)多采用過(guò)SPE柱的方法，涉及固相萃取柱的選擇和洗脫試劑的選擇等因素，有時(shí)凈化效果還不夠理想。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了兩種方法，先采用液-液萃取法，利用苯丙酸諾龍?jiān)诓煌軇┲腥芙舛鹊牟町悾和?、叔丁基甲基醚和石油醚混合溶劑?duì)苯丙酸諾龍及諾龍溶解性好，故采用這3種溶劑混合反萃，將水溶性蛋白等雜質(zhì)留在下層溶液中，達(dá)到去蛋白目的，再通過(guò)固相萃取柱，進(jìn)一步凈化，分別比較PEP柱、SLH

柱、XAD-2柱和C18柱對(duì)苯丙酸諾龍、諾龍的凈化效果。檢測(cè)結(jié)果顯示XAD-2幾乎沒(méi)有檢出，SLH柱只有17%回收率，C18和PEP回收率相差不大，故選擇較為常用的C18柱作為固相萃取柱。

2.3 儀器參數(shù)的選擇

流動(dòng)相采用梯度洗脫模式，能使目標(biāo)峰和干擾峰完全分離，形成良好的色譜峰進(jìn)行定性定量。苯丙酸諾龍及諾龍標(biāo)準(zhǔn)溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖和總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 苯丙酸諾龍及諾龍標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和特征離子質(zhì)譜圖Fig.1 Characteristic ion mass spectrum and total ion current chromatogram of nandrolone phenylpropionate and nandrolone

2.4 線性范圍與檢測(cè)限

稱取5份空白樣品各(2±0.05)g，于50mL離心管中，分別加入10、50、250、500μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，放置30min，按提取凈化步驟操作，苯丙酸諾龍和諾龍基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.005～0.25μg/mL，以峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制校準(zhǔn)曲線，苯丙酸諾龍線性回歸方程為Y=21785X+541835，相關(guān)系數(shù)為0.9987；諾龍為Y=143382X+249716，相關(guān)系數(shù)為0.9995。

在空白品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)處理、上機(jī)，得到3倍信噪比的添加濃度，苯丙酸諾龍、諾龍的最低檢測(cè)限為5.0μg/kg。

2.5 回收率與精密度

在南美白對(duì)蝦、草魚(yú)空白樣品中分別進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量做5個(gè)平行樣，結(jié)果見(jiàn)表3、4。苯丙酸諾龍、諾龍?zhí)砑踊厥章史謩e為84.2%～91.3%、76.8%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.8%～13.6%，3.3%～11.3%。樣品添加水平為25.0μg/kg的HPLC-MS/ M S圖見(jiàn)圖2、3。

表3 草魚(yú)中諾龍和苯丙酸諾龍加標(biāo)回收率及精密度(n=5)Table3 Results of recovery and accuracy experiments in grass carp (n=5)

表4 南美白對(duì)蝦中諾龍和苯丙酸諾龍加標(biāo)回收率及精密度(n=5)Table4 Results of recovery and accuracy experiments in Penaeus vannamei (n=5)

圖2 草魚(yú)加標(biāo)樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of grass carp spiked with nandrolone phenylpropionate and nandrolone

圖3 空白南美白對(duì)蝦加標(biāo)樣品的總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of Penaeus vannamei spiked with nandrolone phenylpropionate and nandrolone

3 結(jié) 論

利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)品中苯丙酸諾龍、諾龍殘留量，不僅靈敏度高，而且定性定量準(zhǔn)確，能滿足檢測(cè)要求。

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HPLC-MS/MS Determination of Nandrolone and Nandrolone Phenylpropionate Residues in Aquatic Products

HUANG Dong-mei，SHI Yong-fu，WANG Yuan，CAI You-qiong*
(East China Sea Fishery Research Insititute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)

A method was established for the determination of nandrolone and nandrolone phenylpropionate residues in aquatic products. Samples were extracted with mixed solution after enzymatic hydrolysis, purified with liquid-liquid extraction. Then the impurities were removed by C18column, and the eluant was concentrated and subjected to liquid chromatography-tamden mass spectrometry analysis. Good linear correlation was obtained between the peak area and the concentration in the range of 0.005 0.25μg/mL. The spike recoveries were 76.8%－98.6% and 84.2%－91.3% for nandrolone and nandrolone phenylpropionate standard. The relative standard deviations were all below 13.6%, and the limits of detection was 5.0μg/kg.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry；nandrolone phenylpropionate；residue；aquatic products

O657.63

A

1002-6630(2010)22-0394-04

2010-07-04

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所中央級(jí)公益型科研院所基本科研專項(xiàng)(2007T03)

黃冬梅(1975—)，女，副研究員，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：hdm0103@tom.com

*通信作者：蔡友瓊(1962—)，男，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：caiyouqiong@163.com