尹 歡，李 琦，陳江源，馬寅眾，李 睿，劉志國(guó)*

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

溶血性鏈球菌LAMP檢測(cè)方法的建立

尹 歡，李 琦，陳江源，馬寅眾，李 睿，劉志國(guó)*

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

目的：研究溶血性鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶血性鏈球菌的快速檢測(cè)。方法：針對(duì)溶血性鏈球菌的scpA基因設(shè)計(jì)4條特異性LAMP內(nèi)外引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件；采用包括溶血性鏈球菌在內(nèi)的6種不同菌株進(jìn)行LAMP的特異性檢測(cè)，并酶切鑒定；對(duì)溶血性鏈球菌菌液以無(wú)菌水進(jìn)行10倍系列梯度稀釋后，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)其靈敏度；將菌摻入牛奶樣本并進(jìn)行LAMP檢測(cè)。結(jié)果：本法可快速靈敏地檢測(cè)出溶血性鏈球菌，反應(yīng)特異性高，檢出限為16.7CFU/mL，而牛奶樣本的檢出限則達(dá)10CFU/mL。結(jié)論：LAMP法可用于食品溶血性鏈球菌的快速檢測(cè)。

溶血性鏈球菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)；檢測(cè)；檢出限

溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus)是一種常見(jiàn)的病原微生物，可引起食物中毒與臨床感染，感染人體可導(dǎo)致新生兒敗血癥、腦膜炎、肺炎等多種嚴(yán)重感染性疾病，甚至死亡[1-3]。根據(jù)溶血性鏈球菌族特異性抗原的不同，可將其分為18個(gè)族，其中A、B、C、D、F、G族對(duì)人類有致病能力。

傳統(tǒng)的溶血性鏈球菌分離鑒定法通常需要24～48h才能報(bào)告結(jié)果，且影響因素多，不適合體檢及大規(guī)模的診斷、篩查。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在已建立了以PCR為基礎(chǔ)的多項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)如免疫PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、多重PCR，及以抗原檢測(cè)為主的免疫學(xué)檢測(cè)法[4-8]。這些檢測(cè)方法快捷、靈敏，準(zhǔn)確度較高。但是，這些針對(duì)單一族溶血性鏈球菌的現(xiàn)代檢測(cè)方法均需一定的設(shè)備和技術(shù)要求，且試劑費(fèi)用較貴，難以推廣普及。因此，建立溶血性鏈球菌特別是致病性菌株的準(zhǔn)確快速檢測(cè)對(duì)于控制該類細(xì)菌引起的食物中毒具有重要意義。

研究表明，溶血性鏈球菌感染人類宿主與scp基因編碼的C5a-肽酶有關(guān)[9-10]，這一基因在不同的致病性溶血性鏈球菌中有很高的一致性，但不存在于其他菌株中。因此針對(duì)溶血性鏈球菌scp基因建立快速檢測(cè)方法具有重要價(jià)值。近年來(lái)，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法在微生物檢測(cè)中的作用受到關(guān)注。該方法由Notomi[11]等于2000年提出，它利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下自循環(huán)幾十分鐘，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP法具有高特異性、高靈敏性、簡(jiǎn)便、快速、低成本的特點(diǎn)，已在諸多

領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)旨在建立溶血性鏈球菌的特異LAMP法，以便實(shí)現(xiàn)食品中溶血性鏈球菌的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus CICC 10373)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E.coli DH5α)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

Bst DNA聚合酶 紐英倫生物技術(shù)有限公司；dNTP美國(guó)Promega公司；凍干脫纖維羊血 友康基業(yè)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴箱 武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠；YJ-1450超凈工作臺(tái) 江蘇蘇州凈化設(shè)備公司；UNO Ⅱ聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 德國(guó)Whatman Biometra公司；核酸電泳儀 北京六一廠；UV-2000 GIS紫外分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備

煮沸法[14-15]制備靶DNA：挑取溶血性鏈球菌單菌落溶于100μL 無(wú)菌水混勻后，于100℃水浴10min裂解，冰浴2min，然后4℃、12000r/min離心5min，含DNA模板的上清液備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank公布的溶血性鏈球菌 scpA 基因序列，設(shè)計(jì)LAMP特異引物，包括兩條外引物F3、B3和兩條內(nèi)引物FIP、BIP。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增scpA基因的LAMP引物序列Table1 Design of LAMP primers for amplifying the scp A of Streptococcus hemolyticus

1.3.3 LAMP反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系為25μL，包括內(nèi)引物、外引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs、1×ThermoPol buffer以及適量的DNA模板；LAMP產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

選擇不同濃度比例的內(nèi)外引物，改變反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行LAMP反應(yīng)，電泳觀察擴(kuò)增效果，確定最佳反應(yīng)條件。

1.3.4 LAMP特異性檢測(cè)

分別對(duì)包括溶血性鏈球菌在內(nèi)的6種不同菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)LAMP引物的特異性。由于擴(kuò)增目標(biāo)片段含有限制性內(nèi)切酶Ta qⅠ的酶切位點(diǎn)，將模板DNA與酶混合，37℃酶切過(guò)夜，然后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，驗(yàn)證序列的特異性擴(kuò)增。

1.3.5 LAMP靈敏度檢測(cè)

將培養(yǎng)2d的溶血性鏈球菌挑取單菌落，溶于1mL液體血培養(yǎng)基中，混勻后，以無(wú)菌水10倍梯度逐步稀釋菌液，分別取各稀釋菌液100μL進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并煮沸制備DNA，取1μL含模板DNA的上清液進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

1.3.6 牛奶樣本中摻入的溶血性鏈球菌后的LAMP檢測(cè)

以濾過(guò)除菌的市售牛奶作為溶血性鏈球菌的稀釋液，10倍梯度逐步稀釋菌液，并取樣進(jìn)行菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)，制備DNA模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP方法的建立與反應(yīng)條件優(yōu)化

LAMP特異引物使溶血性鏈球菌基因組DNA擴(kuò)增出陽(yáng)性梯狀條帶，而無(wú)模板的無(wú)菌水的陰性對(duì)照沒(méi)有條帶出現(xiàn)。優(yōu)化條件結(jié)果顯示：在其他反應(yīng)條件不變且內(nèi)引物與外引物的濃度比為3:1時(shí)擴(kuò)增效果佳(圖1A)；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到50min時(shí)即出現(xiàn)梯狀條帶，60min反應(yīng)最佳，此時(shí)擴(kuò)增穩(wěn)定(圖1B)；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)55℃有階梯狀條帶，60℃為最佳擴(kuò)增(圖1C)。

圖1 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimal reaction conditions for LAMP method

2.2 LAMP的特異性

如圖2所示，僅溶血性鏈球菌出現(xiàn)陽(yáng)性的梯狀條

帶，其他5株非溶血性鏈球菌均未呈陰性(圖2A)；溶血性鏈球菌DNA模板被TaqⅠ酶切后，無(wú)LAMP擴(kuò)增(圖2B)，表明LAMP引物只針對(duì)溶血性鏈球菌特異基因序列。

圖2 LAMP的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specificity of LAMP for the detection of Streptococcus hemolyticus

2.3 LAMP的靈敏度

圖3 LAMP的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Sensitivity of LAMP for the detection of Streptococcus hemolyticus

以無(wú)菌水將溶血性鏈球菌系列稀釋后，分別取樣LAMP 檢測(cè)(圖3A)，并通過(guò)平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果檢出限為16.7CFU/mL。擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.1μL SYBRGREEN 在紫外光條件下可見(jiàn)熒光(圖3B)。將各稀釋的溶血性鏈球菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示PCR法的檢出限為1.21×103CFU/mL(圖3C)?？梢?jiàn)針對(duì)溶血性鏈球菌scpA基因擴(kuò)增的LAMP法比PCR法更靈敏。

2.4 LAMP法檢測(cè)牛奶中的溶血性鏈球菌

牛奶樣本中摻入溶血性鏈球菌并進(jìn)行系列梯度稀釋后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并平板計(jì)數(shù)，結(jié)果牛奶中溶血性鏈球菌的LAMP檢出限為1.0×101CFU/mL(圖4)。市售牛奶樣本未檢出溶血性鏈球菌。

圖4 牛奶樣本的溶血性鏈球菌LAMP檢測(cè)Fig.4 LAMP detection of Streptococcus hemolyticus in milk samples

3 討 論

采用溶血性鏈球菌的scpA基因序列中的一段特異序列作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的靶序列，針對(duì)6個(gè)不同區(qū)域，設(shè)計(jì)內(nèi)外兩對(duì)引物，保證了LAMP反應(yīng)的特異性擴(kuò)增，并成功檢測(cè)出溶血性鏈球菌菌株，而其他菌的基因不能擴(kuò)增出來(lái)，表明該引物針對(duì)溶血性鏈球菌的scpA基因特異序列有很高的特異性。

鑒于溶血性鏈球菌菌群中對(duì)食品危害最大的是帶有C5a-肽酶的致病菌株，因此檢出該類致病菌十分重要，針對(duì)溶血性鏈球菌scpA基因設(shè)計(jì)特異性LAMP擴(kuò)增引物，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，能有效地檢出致病性溶血性鏈球菌。LAMP檢測(cè)方法的靈敏度非常高[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中針對(duì)這一特異性基因設(shè)計(jì)的LAMP引物可檢出1.67× 101CFU/mL(相當(dāng)于每個(gè)反應(yīng)管最低檢測(cè)限為1.67CFU)，而PCR法的檢出限為1.21×103CFU/mL，實(shí)驗(yàn)表明LAMP法檢測(cè)溶血性鏈球菌的靈敏度更高。LAMP法產(chǎn)物的檢測(cè)多樣化[18-19]，可通過(guò)肉眼觀察、添加熒光染料、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)是否發(fā)生。

在市售牛奶樣本中未檢測(cè)到溶血性鏈球菌污染，通過(guò)將溶血性鏈球菌摻入到牛奶中檢測(cè)，LAMP法檢出限為10CFU/mL?？赡芘Ｄ瘫葻o(wú)菌水更適宜于菌的生長(zhǎng)，提菌DNA前菌有少量增長(zhǎng)，更易檢出。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的溶血性鏈球菌LAMP檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，方便快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為溶血性鏈球菌的檢測(cè)提供了新的方法，可廣泛用于食品中致病性溶血性鏈球菌的快速檢測(cè)。

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Establishment of Loop-mediated Isothermal Amplification for the Detection of Streptococcus hemolyticus

YIN Huan，LI Qi，CHEN Jiang-yuan，MA Yin-zhong，LI Rui，LIU Zhi-guo*
(College of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Objective: To develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the rapid detection of Streptococcus hemolyticus. Methods: According to the scpA gene of Streptococcus hemolyticus, 4 specific primers were designed for LAMP amplification. Six different Streptococcus hemolyticus strains were validated by LAMP and identified by enzymatic digestion. The sensitivity of LAMP method was evaluated by serial gradient dilution of Streptococcus hemolyticus solution. Results: LAMP could be used for the rapid and sensitive detection of Streptococcus hemolyticus with a high sensitivity and a detection limit of 16.7 CFU/mL. Moreover, the detection limit was 10 CFU/mL in milk samples. Conclusion: LAMP method is a simple, rapid and feasible method for the detection of Streptococcus hemolyticus.

Streptococcus hemolyticus；loop-mediated isothermal amplification；detection；detection limit

Q93.3

A

1002-6630(2010)22-0311-04

2010-06-27

武漢市科技局對(duì)外科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(201070934341)；武漢工業(yè)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金重點(diǎn)項(xiàng)目(09cx002)

尹歡(1987—)，女，碩士研究生，主要從事食品微生與食品安全研究。E-mail：huanyin1011@126.com

*通信作者：劉志國(guó)(1963—)，男，教授，博士，主要從事生物技術(shù)與食品安全研究。E-mail：zhiguo_1@126.com