曹 亮，周建軍*，魏 銳，劉益紅

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

虎杖中白藜蘆醇發(fā)酵和提取工藝

曹 亮，周建軍*，魏 銳，劉益紅

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

目的：對虎杖中白藜蘆醇的發(fā)酵和提取工藝進行研究。方法：以漢中地區(qū)的虎杖為原料，通過正交試驗研究虎杖中白藜蘆醇自然發(fā)酵和提取條件。結(jié)果：最佳發(fā)酵條件為溫度45℃、料液比1:3、發(fā)酵時間48h、白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率為96.1%；自然發(fā)酵后最佳提取條件為98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1h，白藜蘆醇的得率達1.912%；通過發(fā)酵和提取，虎杖中白藜蘆醇的提取率達90%。結(jié)論：本實驗可為虎杖中白藜蘆醇的發(fā)酵和提取提供一定參考。

虎杖；白藜蘆醇；白藜蘆醇苷；發(fā)酵

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc)為蓼科多年生灌木狀草本植物，主要分布于我國長江以南各地和陜西、湖北及四川等地?；⒄群喾N有效成分，主要包括蒽醌和芪類化合物，其中芪類化合物中的白藜蘆醇具有重要生物活性[1-3]。

白藜蘆醇(Res)化學(xué)名3,4,5-三羥基-二苯乙烯，分子式C14H12O3，熔點256～257℃。易溶于極性溶劑如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等[4-5]。在植物體內(nèi)主要以白藜蘆醇苷(PDT)形式存在。

目前，虎杖中白藜蘆醇提取方法主要有兩類，一類是先提取白藜蘆醇苷，然后再利用專一性酶[6-7]將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，但在提取純化苷的過程中，原有的部分白藜蘆醇會丟失；另外一類方法是采用專一性酶[8]或是篩選專一性微生物[9]先將虎杖發(fā)酵使白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，然后再提取純化，雖然避免了虎杖中原有白藜蘆醇的損失，但操作繁瑣，成本較高。也有報道[10]利用虎杖中微生物產(chǎn)生的酶進行發(fā)酵，但對于發(fā)酵后的提取工藝報道各異。本實驗先將虎杖進行自然發(fā)酵，然后重點對提取工藝進行研究，通過優(yōu)化發(fā)酵條件及提取工藝，為白藜蘆醇工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎杖(經(jīng)陜西理工學(xué)院趙樺教授鑒定)產(chǎn)自秦嶺南坡中段漢中市留壩縣生產(chǎn)基地，先將虎杖切片，40℃干燥至質(zhì)量恒定，用中藥粉碎機粉碎成細(xì)粉備用。經(jīng)索氏提取，HPLC測定，虎杖中白藜蘆醇苷的含量3.70%，白藜蘆醇含量0.27%。

甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)；超純水 自制；白藜蘆醇苷對照品、白藜蘆醇對照品 中國生物制品研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀 美國Waters公司；302型電熱鼓風(fēng)干燥箱 山東濰坊醫(yī)藥集團股份有限公司醫(yī)療器械廠；FW-177型中藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；AB204型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；恒溫氣候箱、SHH421-420型恒溫水浴鍋 河北航天儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

1.3.1.1 液相色譜條件

參考周建軍等[11-12]的檢測方法：色譜柱Symmertry-C18(3.9mm×150mm)，流動相乙腈-水(19.5:80.5)，流速1.0mL/min，柱溫28℃，檢測波長303nm，進樣量10μL，保留時間14min。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精確稱量白藜蘆醇苷4.0mg和白藜蘆醇3.0mg，分別置于100mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解，再定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為40μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為30μg/mL)。

將儲備液配成5個不同質(zhì)量濃度的混合液作為對照品溶液：1)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為4.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為27.00μg/mL的對照品溶液；2)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為8.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為21.00μg/mL的對照品溶液；3)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為12.0μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為15.00μg/mL的對照品溶液；4)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為16.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為9.00μg/mL的對照品溶液；5)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為20.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為3.00μg/mL的對照品溶液。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將5個不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇對照品混合液依次分別進樣10μL，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，用直線回歸方程的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，白藜蘆醇苷的直線方程為：Y=34983X+3570(r2=0.99991)，其質(zhì)量濃度在4.00～20.00 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；白藜蘆醇的直線方程為：Y=57938X+19801(r2=0.99994)，其質(zhì)量濃度在3.00～27.00μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.1.4 供試品溶液的制備

精確稱取虎杖粉末10.00g，按照一定的料液比加水，在恒溫培養(yǎng)箱中按照設(shè)定的溫度發(fā)酵，然后將發(fā)酵物按比例加入溶劑，回流提取3次，合并3次濾液，精確吸取濾液1mL，用甲醇定容到10mL，用0.45μm樣品過濾器過濾，待測。

1.3.1.5 含量測定

樣品溶液在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件下進樣，重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中白藜蘆醇苷及白藜蘆醇的含量，樣品色譜圖見圖1。

圖1 樣品液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of the sample

1.3.2 試驗設(shè)計

1.3.2.1 發(fā)酵條件的選擇

根據(jù)瞿衛(wèi)林[13]的報道和曹庸[14]的專利，選擇發(fā)酵時間、溫度、料液比為考察因素，設(shè)計正交試驗進行發(fā)酵條件的選擇，并根據(jù)最優(yōu)條件進行驗證性實驗。因素水平見表1。

表1 發(fā)酵條件正交試驗因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

1.3.2.2 提取條件的選擇

按最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵后，選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)和提取時間作為考察因素，進行正交試驗，選擇最佳提取條件，并根據(jù)最佳提取條件進行驗證性實驗。因素水平見表2。

表2 提取條件正交試驗因素水平Table2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件正交試驗

發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果和方差分析見表3、4。

表3 發(fā)酵條件正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 Design and results orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

從發(fā)酵正交試驗結(jié)果和極差分析看出，各因素的影響順序為發(fā)酵時間＞溫度＞料液比，通過對白藜蘆醇發(fā)酵條件的選擇以及經(jīng)濟效益的綜合考慮，可以得出白藜蘆醇發(fā)酵的最佳條件：料液比1:3、溫度45℃、發(fā)酵時間48h。

表4 發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

方差分析表明：發(fā)酵時間對白藜蘆醇含量的影響極顯著(F＞F(0.01))，發(fā)酵溫度對白藜蘆醇含量的影響顯著(F(0.01)＞F＞F(0.05))，而料液影響不顯著(F＜F(0.05))。

2.2 發(fā)酵條件驗證性實驗

根據(jù)發(fā)酵正交試驗最佳工藝，進行驗證性實驗(n=3)，結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵條件驗證性實驗結(jié)果Table5 Results of confirmatory experiments for optimizing fermentation conditions

表5結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率達96.1%[(3.683－0.143)/3.683]，表明虎杖中絕大部分白藜蘆醇苷已轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。

2.3 提取條件正交試驗結(jié)果

提取條件正交試驗結(jié)果和方差分析見表6、7。

表6 提取條件正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table6 Design and results orthogonal experiment for optimizing extraction conditions

表7 提取條件正交試驗結(jié)果方差分析Table7 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions

從提取條件正交試驗結(jié)果和極差分析看出，各因素的影響順序為甲醇體積分?jǐn)?shù)＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時間，得出虎杖發(fā)酵后白藜蘆醇的最佳提取條件：98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1 h。

方差分析表明，甲醇體積分?jǐn)?shù)對發(fā)酵后提取影響極顯著(F＞F(0.01))，提取次數(shù)和料液比影響顯著(F(0.01)＞F＞F(0.05))，而提取時間影響不顯著(F＜F(0.05))。

2.4 提取條件驗證性實驗

根據(jù)提取正交試驗確定的最佳工藝，精確稱取虎杖粉末10.00g，進行3次驗證性實驗，結(jié)果見表8。

表8 提取條件驗證性實驗結(jié)果Table8 Results of confirmatory experiments for optimizing extraction conditions

表8表明，虎杖發(fā)酵后白藜蘆醇提取的平均得率1.912%，RSD值0.53%。說明本實驗?zāi)軐⒋蟛糠职邹继J醇提取出來，并且結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

采用干虎杖加水自然發(fā)酵，不需要專一性的酶和培養(yǎng)專一性的微生物，降低了成本、簡化了工藝。通過正交試驗得出白藜蘆醇的最佳發(fā)酵條件：溫度45℃、料液比1:3、發(fā)酵時間48h；白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率達96.1%，這與瞿衛(wèi)林[13]等的報道基本一致。

通過正交試驗得出白藜蘆醇的最佳提取條件：98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1h。虎杖中白藜蘆醇的得率為1.912%，提取率達90%，結(jié)果遠遠高于向海艷[15]和董學(xué)偉[6]等的報道。本實驗結(jié)果為白藜蘆醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

[1]周建軍. 虎杖中二苯乙烯類化合物藥理作用研究進展[J]. 西北藥學(xué)雜志, 2000, 15(2): 86-87.

[2]劉培勤, 郭傳勇. 白藜蘆醇藥理作用的研究進展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2006, 25(6): 524-525.

[3]王燕. 白藜蘆醇的生物學(xué)功能及其應(yīng)用前景[J]. 中國飼料, 2006(16): 22-24.

[4]王永紅, 何麗君, 李生英, 等. 白藜蘆醇[J]. 甘肅高師學(xué)報, 2009, 14 (2): 54-56.

[5]鄭乾剛, 方志杰, 高軍峰. 白藜蘆醇的藥理活性及制備方法[J]. 化學(xué)試劑, 2006, 28(2): 75-78.

[6]董學(xué)偉, 余慧琳, 陳莉, 等. 酶轉(zhuǎn)化虎杖苷制備白藜蘆醇[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(12): 122-124.

[7]寧靜恒, 向海艷. 酶法提取虎杖中白藜蘆醇和大黃素工藝研究[J]. 茂名學(xué)院學(xué)報, 2008, 18(3): 15-18.

[8]林玉葉, 易躍能. 酶解法提取虎杖中白藜蘆醇[J]. 中南藥學(xué), 2009, 7 (4): 262-265.

[9]呂之堯, 郭崇華. 微生物酶法從虎杖中提取白藜蘆醇的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(5): 283-286.

[10]鄒賢德, 舒鑫. 提取中藥虎杖中白藜蘆醇含量的方法: 中國, CN1385535[P]. 2002.

[11]周建軍, 張宏杰, 楊培君, 等. 漢中地區(qū)虎杖中白藜蘆醇甙及甙元含量的測定[J]. 中草藥, 2002, 33(5): 414-416.

[12]曹亮, 周建軍, 張琳. 不同生長年限虎杖中白藜蘆醇苷及苷元含量比較[J]. 中成藥, 2009, 31(6): 897-900.

[13]瞿衛(wèi)林, 陳曉祥, 趙伯濤, 等. 酶解法提高虎杖中白藜蘆醇含量的研究[J]. 中國野生植物資源, 2005, 24(4): 52-55.

[14]曹庸, 于華忠. 微生物轉(zhuǎn)化虎杖材料提取高純白藜蘆醇的工藝: 中國, CN1896255[P]. 2006.

[15]向海艷, 戴開金, 羅奇志. 酶解法對提取虎杖中白藜蘆醇的應(yīng)用及工藝優(yōu)化[J]. 中南大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2008, 39(4): 700-704.

Fermentation and Extraction of Resveratrol from Polygonum cuspidatum

CAO Liang，ZHOU Jian-jun*，WEI Rui，LIU Yi-hong
(School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China)

Objective: To explore the fermentation and extraction processing of resveratrol from Polygonum cuspidatum. Methods: Polygonum cuspidatum from Hanzhong area was used as the material to explore the optimal fermentation and extraction conditions of resveratrol by orthogonal experiments. Results: The optimal conditions for fermentation were fermentation temperature of 45 ℃, material-liquid ratio of 1:3, and fermentation time of 48 h. The conversion rate of polydatin was 96.1% under the optimal fermentation conditions. The optimal conditions for the extraction of resveratrol were 98% methanol as solvent, solid-liquid ratio of 1:6, extraction time of 1 h, and extraction repeat number of 3. The yield of resveratrol was 1.912% under the optimal extraction conditions. The extraction rate of resveratrol could reach up to 90% through optimal fermentation and extraction. Conclusion: These studies provide a theoretical reference for the fermentation and extraction of resveratrol from Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc；resveratrol；polydatin；fermentation

TQ214

A

1002-6630(2010)22-0207-04

2010-06-23

曹亮(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為植物資源開發(fā)與利用。E-mail：phas0614@tom.com

*通信作者：周建軍(1953—)，男，教授，碩士，研究方向為生物資源開發(fā)利用。E-mail：jjzhou01@163.com