蔣 雨，陳安均，于 新*，褚福紅，趙美美

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取野菊花抑菌物質(zhì)工藝

蔣 雨1，陳安均1，于 新2,*，褚福紅3，趙美美2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

以野菊花的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，研究響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化微波輔助提取野菊花抑菌物質(zhì)的工藝參數(shù)。得到乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，最佳參數(shù)為液固比40:1(mL/g)、提取時(shí)間15min、微波功率480W。經(jīng)驗(yàn)證在此條件下，野菊花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到27.02mm，與預(yù)測(cè)值24.56mm差異不顯著，置信區(qū)間大于95%。

野菊花；RSM；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)；微波提??；抑菌

野菊花為菊科植物北野菊(C. boreale Mak.)或巖香菊(C. lavandulaefolium Mak.)的頭狀花序[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，野菊花具有消炎[2]、緩解痛風(fēng)[3]、降血壓、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈并防止其粥樣硬化[4]等作用。據(jù)報(bào)道，野菊花提取物對(duì)植物性病原菌有很好的抑制效果[5]，對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制率達(dá)到94.9%[6]。研究發(fā)現(xiàn)野菊花中主要的抑菌活性物質(zhì)包括：黃酮類化合物[4,7]、菊甙[8]、萜類物質(zhì)[9]及揮發(fā)性物質(zhì)[10-11]。目前，對(duì)于野菊花抑菌物質(zhì)的提取多采用傳統(tǒng)的熬煮法和溶劑提取法[6,12]。較傳統(tǒng)方法，微波輔助提取采用能夠吸收微波能量的極性溶劑為提取劑，具有加熱快、加熱均勻及無(wú)溫度梯度等特點(diǎn)[13]。本研究根據(jù)多元回歸分析多個(gè)獨(dú)立變量及其交互關(guān)系對(duì)依變量的影響[14]，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了微波提取野菊花抑菌物質(zhì)的工藝條件，旨在對(duì)野菊花的深入研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

野菊花(巖香菊的頭狀花序)購(gòu)于廣州市藥店；無(wú)水乙醇、三氯甲烷均為分析純；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉浸膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂粉15g、純水1000mL，pH7.3)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室。MJ-176NR型多功能粉碎機(jī) 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；G8023CSL-K3型微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī) 上海安寧科學(xué)儀器廠；R系列-

旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀 無(wú)錫星海生化設(shè)備有限公司；SW-CJIF型無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試液的制備

稱取野菊花粉末(過(guò)40目篩)5g，加入一定比例提取溶劑，梯度設(shè)置微波功率(功率=火力/%×輸出功率8 0 0W)，采用間歇微波提取方法(加熱1 mi n，放置3min)。過(guò)濾提取液，4000r/min離心10min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(50℃)濃縮至5mL，4℃保藏備用。以等體積未加野菊花直接微波處理，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5mL的提取溶劑為對(duì)照。

1.2.2 菌懸液的制備

將供試菌種接于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋至6～7lg(CFU/mL)，備用[15]。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定供試液的抗菌活性[16]。在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中倒入10mL左右的無(wú)菌的瓊脂溶液，凝固后在上面安放牛津杯。培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，每100mL培養(yǎng)基中加入2mL的菌懸液，搖勻后迅速倒入安放牛津杯的培養(yǎng)皿中(每皿約15mL)，冷卻后拔出牛津杯，每孔加入150μL供試液或?qū)φ找海?7℃恒溫培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈直徑。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)重復(fù)(組間組內(nèi)各兩次)。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定因素水平，采用Design-Excerpt 7.0.0軟件中的Box-Behnken法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，優(yōu)化微波輔助提取野菊花抗菌物質(zhì)的工藝參數(shù)，以提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，具體試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken設(shè)計(jì)因素及水平Table1 Factors and levels of Box-Benhnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)選用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%乙醇溶液、無(wú)水乙醇和三氯甲烷為提取溶劑，按液固比20:1(mL/g)添加，三氯甲烷為50℃索氏抽提3h，其余為微波160W提取5min。對(duì)照組均無(wú)抑菌圈，提取物的抑菌結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢钥闯?，極性溶劑的提取液中有效抑菌物質(zhì)較多，其中以50%乙醇為最佳。因此，試驗(yàn)選用50%乙醇溶液為提取溶劑。

圖1 不同溶劑提取物抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of extracts with different solvents

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響

設(shè)定液固比為20:1(mL/g)，微波功率為160W，微波浸提2～18min，研究微波加熱時(shí)間對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響，結(jié)果如圖2所示。微波提取10min時(shí)野菊花提取物的抑菌活性最大。2～10min內(nèi)，抑菌圈直徑不斷增大，微波能快速進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量熱量導(dǎo)致其膨脹破壁，而且熱擴(kuò)散與分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)方向一致，加速提取溶劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的滲透[17]。浸提10min之后，抑菌圈直徑有所減小，這可能與較長(zhǎng)時(shí)間暴露于微波條件下，提取物中部分具有抑菌活性物質(zhì)分解有關(guān)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)抑菌圈活性的影響Fig.2 Effect of extraction time on the antibacterial activities of the extract

2.1.3 液固比對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響

設(shè)定微波功率160W，提取時(shí)間10min，液固比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1(mL/g)。野菊花提取物的抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，液固比30:1(mL/g)時(shí)，野菊花提取物的抑菌活性最強(qiáng)。繼續(xù)增大液固比，抑菌活性變化不大。這可能是因?yàn)楫?dāng)液固比達(dá)到一定的比例時(shí)，抑菌活性物質(zhì)已被充分提取。因此從試驗(yàn)及成本角度考慮，選取液固比為30:1為宜。

圖3 液固比對(duì)抑菌活性的影響Fig.3 Effect of liquid/solid on the antibacterial activities of the extract

2.1.4 微波功率對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響

設(shè)定液固比30:1(mL/g)，在不同微波功率(火力為20%、40%、60%、80%、100%時(shí)，對(duì)應(yīng)的功率分別為160、320、480、640、800W條件下處理10min，野菊花提取物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。在微波功率320W條件下，提取物的抑菌活性達(dá)到最高值，繼續(xù)增加微波功率，活性反而下降。在其他參數(shù)一定的條件下，微波功率越大，提取溶劑溫度升高越快，高溫環(huán)境對(duì)活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞作用也更強(qiáng)[18]；另一方面，較高功率條件下的微波可能導(dǎo)致一部分極性較強(qiáng)的抑菌活性物質(zhì)高頻運(yùn)動(dòng)而熱降解[14]。

圖4 微波功率對(duì)抑菌活性的影響Fig.4 Effect of microwave power on the antibacterial activities of the extract

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到微波時(shí)間(X1)、液固比(X2)和微波功率(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型：

該方程的決定系數(shù)R2=0.9152。表3表明，微波提取時(shí)間一次項(xiàng)、微波提取時(shí)間和微波功率的交互項(xiàng)、微波功率二次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。微波提取時(shí)間一次項(xiàng)、微波功率一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。整體模型達(dá)極顯著水平(P＜0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(F=2.43)。表明該二次方程模型比較顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)不同條件下的野菊花提取物的抑菌活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。另外，該模型的變異系數(shù)為3.46%，在可接受范圍內(nèi)。變異系數(shù)是衡量每個(gè)平均值偏離情況的參數(shù)，其值越小，重復(fù)性越好。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

表3 回歸模型方差分析Table3 ANOVA for the regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert 7.0.0軟件，根據(jù)所得回歸方程分析作響應(yīng)面(圖5～7)。如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[19]。從

另一個(gè)方面也說(shuō)明因素間存在較強(qiáng)的交互作用，因素間的輕微改變可導(dǎo)致結(jié)果的較大變化。圖5顯示在微波功率320W條件下，微波時(shí)間與液固比對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響，可以看出，抑菌活性隨著液固比的提高呈近線性增加；提取時(shí)間對(duì)提取物抑菌活性的影響基本呈二次關(guān)系。液固比值較低時(shí)，提取時(shí)間12min，野菊花提取物的抑菌活性達(dá)到最大值；隨著液固比增加，野菊花提取物抑菌活性達(dá)到最大的提取時(shí)間延長(zhǎng)。液固比為40:1(mL/g)時(shí)，提取15min，提取物的抑菌活性達(dá)到最大；圖6顯示液固比為30:1(mL/g)時(shí)，微波功率與提取時(shí)間對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響，微波功率與提取時(shí)間之間的交互作用明顯，這與方差分析結(jié)果一致。微波功率和時(shí)間共同增加時(shí)，野菊花提取物的抑菌活性增大，微波功率480W，提取時(shí)間15min抑菌活性達(dá)到最大；圖7顯示微波提取10min時(shí)，微波功率和液固比對(duì)野菊花提取物抑菌活性的影響，可以看出，微波功率為160W時(shí)，野菊花提取物抑菌活性隨液固比增大而減弱；微波功率為350W時(shí)，隨著液固比增大，抑菌活性先減弱后逐漸增強(qiáng)；微波功率為480W時(shí)，抑菌活性隨液固比增大而增強(qiáng)。

圖5 液固比和時(shí)間對(duì)抑菌活性影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plot showing the effects of liquid/solid ratio and extraction time on the antimicrobial activity of the extract

圖6 微波功率和時(shí)間對(duì)抑菌活性影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plot showing the effects of microwave power and time on the antimicrobial activity of the extract

圖7 功率和液固比對(duì)抑菌活性影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface plot showing the effects of microwave power and liquid/solid ratio on the antimicrobial activity of the extract

2.2.3 提取工藝的優(yōu)化

圖8 提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面Fig.8 Response surface plot showing the effect of microwave power and liquid/solid ratio on the antimicrobial activity of the extract

利用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化分析，結(jié)果如圖8所示。結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，可以判斷微波提取野菊花抑菌物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液、微波功率480W、液固比40:1 (mL/g)，提取15min，在此條件下預(yù)測(cè)的抑菌圈直徑為24.56mm。該試驗(yàn)點(diǎn)剛好處于響應(yīng)面的邊緣處，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)偏離較大，說(shuō)明試驗(yàn)所選因素間存在較強(qiáng)的交互作用[20]。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在此最佳條件下提取的野菊花提取物的抑菌活性最大，4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑平均值達(dá)到27.02mm，與相應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果24.56mm差異不顯著，置信區(qū)間CI(confidence interval)＜95%。

3 結(jié) 論

以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇提取野菊花抑菌物質(zhì)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，提取參數(shù)(微波提取時(shí)間、液固比、微波功率)最終獲得最佳提取條件為微波功率480W、液固比40:1(mL/g)、提取15min、經(jīng)驗(yàn)證在此條件下抑菌圈直徑為27.02mm(CI＞95%)。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1991: 2144-2145.

[2]CHENG Wenming, LI Jun, YOU Tianpa, et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of the extracts from the inflorescence of Chrysanthemum indicum Linné[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2005, 101(1/2/3): 334-337.

[3]KONG L D, CAI Y, HUANG W W, et al. Inhibition of xanthine oxidase by some Chinese medicinal plants used to treat gout[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2000, 73(1/2): 199-207.

[4]朱慶書, 趙文英. 超聲提取野菊花總黃酮及其抑菌活性的研究[J]. 化學(xué)與生物工程, 2008, 25(12): 72-74.

[5]ALVAREZ-CASTELLANOS P P, BISHOP C D, PASCUALVILLALOBOS M J . Antifungal activity of the essential oil of flowerheads of garland chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium) against agricultural pathogens[J]. Phytochemistry, 2001, 57(1): 99-102.

[6]萬(wàn)大偉, 魏艷, 李園園, 等. 野菊花提取物對(duì)19種病原真菌的生物活性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(2): 102-104.

[7]魏艷, 萬(wàn)大偉, 孟昭禮, 等. 野菊花中殺菌活性物質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(4): 74-76.

[8]毛勝鳳, 張新鳳, 余樹(shù)全. 不同成熟期野菊花提取物抑菌效果比較研究[J]. 浙江林業(yè)科技, 2006, 26(5): 43-54.

[9]侯冬巖, 郭華, 李鐵純, 等. 千山野菊花萜類化合物的分析[J]. 沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2003, 21(4): 303-306.

[10]BUKET C A, HASAN B F, SELGUK K. Antimicrobial activity and chemical composition of some essential oils[J]. Arch Pharm Res, 2002, 25(6): 860-864.

[11]胡浩斌, 鄭旭東. 子午嶺野菊花揮發(fā)油的化學(xué)成分及抑菌活性[J]. 新疆大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 22(3): 295-208.

[12]方靜, 王德, 周學(xué)琴. 野菊花兩種提取方式對(duì)5種常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌效果的比較[J]. 數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志, 2007, 20(3): 368-369.

[13]劉忠英, 胡秀麗, 卜鳳泉, 等. 微波輔助提取刺五加中黃酮類化合物過(guò)程中的化學(xué)變化研究[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 28(3): 431-435.

[14]JEONG G T, KIMD H, PARKD H. Response surface methodological approach for optimization of free fatty acid removal in feedstock[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2007, 137/140: 583-594.

[15]常銀子, 仲山民, 曹玉成, 等. 野菊花、金銀花和蘆薈復(fù)合提取液抑菌作用的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(16): 4872-4874.

[16]周邦靖. 常用中藥的抗菌作用及其測(cè)定方法[M]. 重慶: 科學(xué)技術(shù)出版社重慶分社, 1987: 302-303.

[17]郭維圖, 孫福平. 微波提取的基本特性與微波連續(xù)提取裝置[J]. 機(jī)電信息, 2010(8): 28-31; 34.

[18]任紅榮, 姜洪芳, 單承鶯, 等. 微波提取香水蓮花總黃酮的工藝研究[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2010, 29(2): 30-33.

[19]楊佳, 張國(guó)文, 汪佳蓉, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取贛南臍橙皮中黃酮類化合物的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(16): 94-97.

[20]SUMANT P, QASIM K B, RANI G. Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp. by response surface methodology[J]. Current Microbiology, 2002, 44: 286-290.

Microwave-assisted Extraction of Antibacterial Substances from Inflorescence of Chrysanthemum lavandulaefolium (Fisch.) Mak.

JIANG Yu1，CHEN An-jun1，YU Xin2,*，CHU Fu-hong3，ZHAO Mei-mei2
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Box-Behnken experimental design coupled with response surface analysis was employed to optimize the microwaveassisted extraction of antibacterial substances using 50% aqueous ethanol form the inflorescence of Chrysanthemum lavandulaefolium (Fisch.) Mak. Anti-Staphylococcus aureus activity of the extract was investigated by determining the diameter of inhibition zone. The optimal conditions of microwave extraction were as follows: liquid-to-solid ratio 40:1(mL/g), microwave treatment time 15 min, microwave power 480 W. The experimental diameter of inhibition zone was 27.02 mm, which was in accordance with the predicted value of 24.56 mm.

Chrysanthemum lavandulaefolium (Fisch.)Mak.；RSM；Box-Behnken；microwave extraction；antibacteria

R282.71；O658.2

A

1002-6630(2010)22-0059-05

2010-01-31

蔣雨(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：jiangrong1958@yahoo.com.cn

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn