傅春燕，周丹珺，陸 焰，劉冰冰，楊文鴿*

(寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

響應面法優(yōu)化鮐魚頭酶解條件

傅春燕，周丹珺，陸 焰，劉冰冰，楊文鴿*

(寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

以鮐魚頭為原料，水解度為指標，采用單因素試驗，比較中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶對鮐魚頭的酶解效果，并進一步對風味蛋白酶的酶解工藝參數(shù)進行響應面法優(yōu)化。結果表明：風味蛋白酶的酶解效果最好，其加酶量、酶解溫度和時間對水解度均有極顯著影響(P＜0.01)；響應面法優(yōu)化得到鮐魚頭酶解的最適條件為風味蛋白酶添加量1311U/g、酶解溫度46℃、反應時間7h，鮐魚頭的水解度達到31.18%。

響應面；鮐魚頭；酶解；水解度

鮐魚(Pneumatophorus japonicns)，又名青鲇魚，是海洋中上層低值魚類，在我國各海域均有分布，尤以東海產(chǎn)量最多。鮐魚也是我國重要的加工魚種，每年加工成各類冷凍魚片和魚罐頭數(shù)量達萬噸[1]，而加工產(chǎn)生的魚頭、魚骨和內(nèi)臟往往成了水產(chǎn)品下腳料。這些下腳料一般加工成魚粉或直接作為廢物處理，高值化利用程度較低，因此開發(fā)利用鮐魚加工下腳料具有重要意義。

研究表明：腸道能有效吸收蛋白水解物，尤以三肽吸收為最好[2]。另外，低分子肽不僅是重要氮源[3]，還具有眾多生理功能，如降血壓[4]、抗氧化[5]、提高免疫力[6]、防腐和抑菌等作用[7]。因此，酶解魚品下腳料以獲得較高價值的多肽類物質(zhì)已成為目前的研究熱點。Guerard等[8]利用中性蛋白酶酶解鮪魚下腳料，以制備魚蛋白粉；Bougatef等[9]酶解沙丁魚頭與內(nèi)臟，以提取活性多肽。本實驗利用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及風味蛋白酶對鮐魚頭進行酶解，篩選到合適的酶種類，并對酶解工藝進行優(yōu)化，以獲得易消化吸收的酶解液，為進一步開發(fā)利用鮐魚頭資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鮐魚(P. japonicns)采自3～4月，每尾質(zhì)量(200 ±20)g，購于寧波水產(chǎn)大世界，取鮐魚頭，經(jīng)高速組織搗碎機搗碎均勻，凍藏備用；木瓜蛋白酶(11.8萬U/g)廣西南寧龐博生物工程有限公司；中性蛋白酶(19.1萬U/g)、風味蛋白酶(2.2萬U/g) 無錫市雪梅酶制劑科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BP221S型電子分析天平、Docu pH計 德國Sartorius公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機 德國Thermo

Fisher Scientific公司；XHF-1型內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器上海雷磁儀器廠；DS-1型高速組織搗碎機 上海標本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 一般營養(yǎng)成分的測定

水分：105℃烘干法；總蛋白量[10]：半微量凱式定氮法；脂肪含量[11]：氯仿-甲醇法；灰分：550℃灼燒法。

1.3.2 鮐魚頭酶解液的制備流程

鮐魚頭→搗碎均勻→加入一定比例的水攪拌均勻→酶解→滅酶(沸水浴10min)→冷卻→離心→取上清液→水解度測定

1.3.3 水解度的測定

以甲醛電位滴定法測定氨基酸態(tài)氮；水解度(DH)計算公式如下：

DH/%=(酶解液中的氨態(tài)氮總量－原料中本身含有的氨態(tài)氮總量)/原料中總氮含量×100

1.3.4 蛋白酶活力的測定

Folin-酚法[12]測定蛋白酶活力。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1.3軟件，進行響應面試驗設計及數(shù)據(jù)分析。實驗設置3～5個平行樣。

2 結果與分析

2.1 鮐魚頭原料的一般營養(yǎng)成分

表1 鮐魚頭的一般營養(yǎng)成分Table1 The basic nutritional components of P. japonicns heads

由表1可以看出，鮐魚頭水分含量為64.36%，相對較高，不易保藏；其粗蛋白質(zhì)含量達13.63%，是一種很好的蛋白質(zhì)資源，值得開發(fā)利用。

2.2 鮐魚頭酶解工藝的單因素試驗

2.2.1 加酶量的確定

取鮐魚頭原料，添加2倍質(zhì)量的水，50℃保溫5min后，分別加入0.6×103、0.8×103、1.0×103、1.2 ×103、1.4×103、1.6×103、1.8×103、2.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，50℃酶解7h，立即終止酶反應。取樣測定其水解度，結果見圖1。

圖1 加酶量對鮐魚頭水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the DH of P. japonicns heads

由圖1可知，當加酶量從0.6×103U/g遞增到1.0× 103U/g，3種酶的水解效果均不斷增加，但超過1.0× 103U/g后，水解度增加不明顯。中性蛋白酶添加量1.0× 103U/g時，水解度達到最大13.03%，隨后甚至有所下降；木瓜蛋白酶的水解度隨著酶添加量的增加不斷增加，但增加量不大；3種酶中風味蛋白酶的水解效果最好，添加量達1.2×103U/g時水解度最大。這與洪鵬志等[13]對研究黃鰭金槍魚頭酶解條件得到的結論相似，中性蛋白酶、風味酶在酶添加量超過1.4×103U/g原料后，木瓜蛋白酶在酶添加量超過1.1×103U/g原料后，水解效果已趨于平緩。原因在于隨著酶量的增加，酶已逐漸被底物所飽和，酶促反應速度趨向最大值。

2.2.2 酶解溫度的確定

取鮐魚頭原料，添加2倍質(zhì)量的水，分別在40、45、50、55、60℃保溫5min后，加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或風味蛋白酶，在各溫度條件下酶解7h。取樣測定其水解度，結果見圖2。

圖2 溫度對鮐魚頭水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on the DH of P. japonicns heads

從圖2可以看出，由40℃升至50℃，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果不斷增強，但超過50℃后，水解度下降；風味蛋白酶在45℃時水解度達到最高，45℃到50℃水解度有所下降但幅度不大，55℃后水解度大幅度下降。溫度的提高在一定程度上能提高一般化學反應的速率，但酶是一種活性蛋白，超過一定溫度后會使

其失去部分催化活性，從而降低酶促反應速率。由圖可知，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶的最適溫度分別是50、50、45℃。

2.2.3 酶解時間的確定

取鮐魚頭原料，添加2倍質(zhì)量的水，50℃保溫5min后，分別加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，5 0℃酶解1、2、3、4、5、6、7h，立即終止酶反應。取樣測定其水解度，結果見圖3。

圖3 酶解時間對鮐魚頭水解度的影響Fig.3 Effect of time on the DH of P. japonicns heads

由圖3可知，隨著時間的延長，3種酶的水解度均有不斷提高，特別是在最初的1h，增加速度最明顯。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在1h后的水解度增加幅度遠小于風味蛋白蛋白酶，風味蛋白酶在5h之前的水解度都在迅速增加，隨后趨于平緩。洪鵬志等[13]研究表明時間對木瓜蛋白酶的酶解效果影響不大，在4h之內(nèi)中性蛋白酶和風味蛋白酶的水解效果均隨著時間的增加而增強；侯溫甫等[14]研究得到淡水魚頭酶解時的最佳酶解時間為5h，本實驗結果與之相近。

2.2.4 料液比的確定

取鮐魚頭原料，按原料質(zhì)量的1、2、3、4、5、6倍添加水，使料液比分別達到1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6(g/mL)，50℃保溫5min后，分別加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，50℃酶解7h，立即終止酶反應。取樣測定其水解度，結果見圖4。

圖4 料液比對鮐魚頭水解度的影響Fig.4 Effect of water dosage on the DH of P. japonicns heads

由圖4可知，中性蛋白酶與風味蛋白酶在1:1(g/mL)時水解度較低，1:2(g/mL)時達到最大，1:2～1:6(g/mL)變化時，中性蛋白酶的水解效果有所下降，風味蛋白酶的水解效果有上下波動，但變化不大；而木瓜蛋白酶的水解效果在料液比1:1、1:2(g/mL)時最大，而后有所降低，與相關研究報道結果相符。周濤等[15]在研究鮐魚廢棄物酶解條件時得到的最佳料液比為5:8(g/mL)；段振華等[16]在研究鳙魚下腳料的酶解時也發(fā)現(xiàn)當料液比從1:1(g/mL)減小到1:2(g/mL)時，水解效果上升最快，而后變緩。因為當反應體系中水分增加時，降低了反應產(chǎn)物的濃度，減輕了產(chǎn)物對酶促反應的反饋抑制作用；而水分進一步增加降低酶濃度，導致了水解效果的下降。

由單因素試驗可以看出，風味蛋白酶在3種酶中的酶解效果最好，最佳反應條件約為酶添加量1.2×103U/g原料、反應溫度45℃、反應時間6h、料液比為1:2 (g/mL)，水解度可達30%以上，而中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的水解度均在15%以下。因此選取風味蛋白酶，并進一步對酶解工藝進行響應面優(yōu)化。

2.3 風味酶酶解鮐魚頭的響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面優(yōu)化試驗因素水平的選取

參考單因素試驗結果，采用響應面方法在三因素三水平上對酶添加量、酶解溫度、酶解時間進行優(yōu)化。根據(jù)中心組合試驗設計原理，試驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面優(yōu)化因素與水平Table2 Factors and levels of the experiment

2.3.2 響應面優(yōu)化試驗設計及結果

表3 響應面優(yōu)化試驗方案及結果Table3 Experimental design and results of the experiment

響應面優(yōu)化試驗設計及結果見表3，方差分析和酶解各因素的顯著性比較結果見表3、4。

表4 水解度回歸模型方差分析表Table4 Variance analysis of regression equation

利用SAS軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：

圖5 酶添加量與溫度對鮐魚頭水解度的影響Fig.5 Response surface showing the effect of enzyme dosage and temperature on the DH of P. japonicns heads

圖6 酶添加量與時間對鮐魚頭水解度的影響Fig.6 Response surface showing the effect of enzyme dosage and time on the DH of P. japonicns heads

用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因素和全體自變量之間的線性關系顯著(R2= 0.9817)，模型達極顯著水平(P＜0.01)，而失擬項F值不顯著，說明方程對實驗擬合較好，因此用此方程模型來模擬3因素與指標值的關系是可行的。影響水解效果的3個因素加酶量、酶解溫度、酶解時間的顯著水平均小于0.01，影響效果極顯著。

圖7 溫度與時間對鮐魚頭水解度的影響Fig.7 Response surface showing the effect of temperature and time on the DH of P. japonicns heads

回歸方程的特征值存在異號，因此在回歸方程所對應的拋物線不存在最大值，需進行嶺分析。將酶添加量、酶解溫度、酶解時間3個參數(shù)分別固定，水解度隨其余兩個參數(shù)變化的趨勢如圖5～7所示。由圖5～7可知：隨著酶添加量與酶解時間的增加，酶解液的水解度不斷提高，但都趨于平緩；隨著酶解溫度的升高，水解度先升高后下降。經(jīng)響應面嶺分析得出3個影響因素的最佳組合為酶添加量1311U/g、溫度46℃、反應時間7h，此時的水解度達到31.31%。為了檢驗模型預測的準確性，在最佳酶解條件下進行實驗，實際測得的水解度為31.18%，可見該模型能較好的預測鮐魚頭的酶解情況。

在上述最佳條件下，得到的鮐魚頭酶解液水解度在31%左右。陳奕華等[17]利用酶法水解鯪魚頭，最佳條件下鯪魚頭的酶解度為30.5%；陳海桂等[18]采用酶水解鮐魚蛋白制取功能性魚蛋白粉，得到水解度為32.4%的鮐魚酶解液；章葉江等[19]雙酶水解鰹魚頭，最佳工藝條件下得到的水解度為23.4%，本實驗結果與前二者接近，但高于章葉江等得到的鰹魚頭水解度。

3 結 論

選擇中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶對鮐魚頭進行酶解，比較其水解度，最終選擇風味蛋白酶，并采用響應面法對風味蛋白酶酶解鮐魚頭的3個主要因素酶添加量、溫度、時間進行優(yōu)化。結果表明，酶添加量1311U/g、溫度46℃、反應時間7h，水解度達

到最高31.18%，所得的酶解液可噴霧干燥加工成水產(chǎn)動物蛋白粉，經(jīng)調(diào)味后有望制成特殊風味的調(diào)味品或經(jīng)調(diào)配制備多肽飲料等，使鮐魚頭變廢為寶。

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Enzymolysis of Pneumatophorus japonicns Heads by Using Response Surface Analysis

FU Chun-yan，ZHOU Dan-jun，LU Yan，LIU Bing-bing，YANG Wen-ge*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The effects of neutral, papain and flavor protease on the degree of hydrolysis of Pneumatophorus japonicns heads were studied, then the enzymolysis conditions of flavor protease were optimized by using response surface method (RSM). The results showed that flavor protease has the best enzymolysis effect. The effect of enzyme dosage, enzymolysis temperature and time on the degree of hydrolysis (DH) were significant. By the RSM transactional analysis, the optimum enzymolysis conditions were optimized as following: enzyme dosage 1311 U/g, enzymolysis temperature 46 ℃ and time 7 h, respectively. The DH was up to 31.18% under the optimum condition.

response surface method；Pneumatophorus japonicns heads；enzymolysis；degree of hydrolysis

S965.327

A

1002-6630(2010)22-0054-05

2010-01-13

浙江省教育廳學科帶頭人培養(yǎng)專項(2008932)；寧波大學博士基金項目(BSL2008003)

傅春燕(1985—)，女，碩士研究生，研究方向水產(chǎn)品加工與高值化利用。E-mail：fuchunyan1017@126.com

*通信作者：楊文鴿(1966—)，女，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品保鮮加工與高值化利用。E-mail：yangwenge@nbu.edu.cn