高文茹，陳慶森*，閻亞麗，龐廣昌，胡志和

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

津晉地區(qū)原料奶中微生物污染程度分析與鑒定

高文茹，陳慶森*，閻亞麗，龐廣昌，胡志和

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

沙門氏菌是一種重要的人畜共患腸道疾病致病菌，它引起的食物中毒已成為一類最常見且危害性較大的細菌性食物中毒。本研究對我國津晉地區(qū)原料奶中微生物污染情況進行分析與鑒定，主要包括菌落總數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌的檢測。結(jié)果顯示：津晉地區(qū)原料奶來源不同，奶源質(zhì)量有較大差別。菌落總數(shù)平均在104～107CFU/mL之間，存在許多超標奶；大腸菌群數(shù)差別較大，晉奶源質(zhì)量很好，大腸菌群數(shù)均低于110MPN/mL，天津地區(qū)乳品廠A大腸菌群數(shù)最高為1100MPN/mL，乳品廠B受到大腸菌群的嚴重污染，幾乎均大于或等于11000MPN/mL；沙門氏菌未檢出。研究證實了津晉地區(qū)原料奶的質(zhì)量和安全性不容忽視。

原料奶；微生物；菌落總數(shù)；大腸菌群；沙門氏菌；污染

原料奶質(zhì)量的高低是影響奶制品質(zhì)量的關鍵，只有優(yōu)質(zhì)的原料奶才能保證生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。如果原料奶的質(zhì)量控制不當，很有可能在生產(chǎn)過程中或者加工后產(chǎn)品貯藏過程中出現(xiàn)嚴重的質(zhì)量問題。大腸菌群和菌落總數(shù)是奶和奶制品的重要質(zhì)量指標，它不僅可以反映成品的衛(wèi)生質(zhì)量和加工過程中的衛(wèi)生情況，而且還可反映運輸、加工和貯藏過程中的溫度控制是否合理。因此，檢測這兩項指標對于乳品加工能起到一定的指導作用。

沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌，無莢膜、周生鞭毛、能運動、少數(shù)不運動，需氧或兼性厭氧菌。沙門氏菌屬廣泛存在于自然界中，它在水中能存活2～3周，糞便中可存活1～2個月，可在冰凍土壤中過冬，在牛乳及肉類中能存活數(shù)月。它是腸桿菌科中常見的一個重要的食源性病原菌屬，是由一群形態(tài)、生物學特

性與血清學上相似或相關的細菌組成[1-3]。目前全世界已分離出2579個血清型，我國已發(fā)現(xiàn)至少322個以上的血清型[4]。與人類疾病有關的血清型主要集中于 A～E 群，其中以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及豬霍亂沙門氏菌最為常見。沙門氏菌引起食物中毒是全球性的，通常占細菌性食物中毒的前一、二位，其在我國多年來占首位[5]。沙門氏菌病是一種重要的人畜共患傳染性疾病，國內(nèi)外多有發(fā)生，由原料奶及奶制品所引起的沙門氏菌病在美國多見于報道[6-7]。沙門氏菌病有幾種傳播途徑，但大多數(shù)人感染還是由于食用了被沙門氏菌所污染的動物性食物，其中禽肉及其他肉類產(chǎn)品是最主要的人源沙門氏菌感染源[8-9]。國外有報道原料奶中沙門氏菌檢出的情況。Chyea等[10]分析了馬來西亞半島360個奶牛場的原料奶的微生物污染情況。其從南部、中部、北部和東部4個地區(qū)采集了930份奶樣進行檢測，幾乎90%的奶樣被大腸菌群所污染，僅有1.4%的奶樣被沙門氏菌所污染。Cetinkaya等[11]分析了土耳其布爾薩省多種食品中沙門氏菌和志賀氏菌的污染情況。其從2004年12月至2005年7月在超市及小型售貨攤上采集了416份食品樣品，包括雞肉、肉餡、即食的色拉醬，蔬菜以及原料奶，結(jié)果顯示僅從雞肉中分離出一株沙門氏菌，志賀氏菌未檢出。Jayarao等[12]分析了因食用原料奶及奶制品而感染致病菌的風險，選取了美國賓夕法尼亞州16個縣郡的248份樣品，共6%的樣品檢出沙門氏菌。

沙門氏菌污染原料奶后，一般不會引起原料奶感官性狀的變化，但在合適的條件下沙門氏菌產(chǎn)生的腸毒素會達到危險水平，足以危害消費者的健康。該毒素不被胰蛋白酶和其他水解蛋白酶所破壞，并對酸堿有抵抗力，因此會嚴重影響原料奶的質(zhì)量，由其制成的奶制品會引起食物中毒，對消費者的安全造成極大影響。因此，從原料奶及奶制品質(zhì)量與安全的角度出發(fā)，很有必要對我國原料奶中沙門氏菌的檢出率、分布情況和血清型進行分析鑒定，以確定污染源、污染途徑，制訂相應的檢測標準和衛(wèi)生安全標準，提供消毒和殺菌的指導，并為應對可能出現(xiàn)的突發(fā)食物中毒事件提供參考依據(jù)。

本研究采用最新國標中規(guī)定的方法對天津和山西兩個地區(qū)的原料奶進行了菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)及沙門氏菌的檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯、緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)培養(yǎng)基、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、三糖鐵(TSI)瓊脂、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、尿素酶、色氨酸肉湯、氰化鉀、氰化鉀對照、衛(wèi)矛醇半固體、甘露醇發(fā)酵管、ONPG、山梨醇發(fā)酵管、丙二酸鹽、水楊苷發(fā)酵管 青島海博生物有限公司。

培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；NiKon ECLIPSE E200顯微鏡；冰箱；恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 原料奶取樣方法

在津晉地區(qū)選取3個有代表性的中型生產(chǎn)規(guī)模以上的乳品廠。其中天津選取兩個乳品廠，山西選取一個乳品廠。每個乳品廠選10個奶牛場或送奶戶，不足10個奶牛場的乳品廠選取其全部奶牛場進行取樣，用進樣器取12mL于無菌的15mL離心管中，做好標記。每個奶場(戶)取3個平行，放入盛有冰塊的真空保溫壺中讓其迅速冷卻，用作衛(wèi)生指標和沙門氏菌的分析鑒定。

1.2.2 菌落總數(shù)的測定

參見GB/T 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[13]。

1.2.3 大腸菌群數(shù)的測定

參見GB/T 4789.3—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[14]。

1.2.4 沙門氏菌的檢驗

參見GB/T 4789.4—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[15]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料奶樣品中細菌總數(shù)的測定及分析

對取自天津、山西地區(qū)的原料奶進行細菌總數(shù)的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。

菌落總數(shù)是判定食品被污染程度的標志，它能反應微生物在食品中的繁殖動態(tài)[16]。食品中細菌數(shù)量越多，說明食品被污染的程度越重、越不新鮮、對人體健康威脅越大。中國對原料奶的微生物標準相對比較寬松，只將牛乳分為4個等級[17]：Ⅰ級細菌數(shù)為5×105個/mL；Ⅱ級為1×106個/mL；Ⅲ級2×106個/mL；Ⅳ級4× 106個/mL。自2001年起我國頒布的NY 5045—2001《無公害食品 生鮮牛乳》[18]中規(guī)定原料奶中菌落總數(shù)不得超過50萬個，至2008年最新頒布的替代NY 5045—2001的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準[19]中仍沿用此微生物限值，可見原料奶中微生物控制標準有所提高，但與發(fā)達國家相比還有很大差距，指標為5×105個/mL的原料奶在很多國家都不能作為液體奶的原料。

表1 我國津晉地區(qū)原料奶樣品的菌落總數(shù)的檢測結(jié)果Table 1 Total bacterial count in raw milk from Tianjin and Shanxi regions

從表1可以看出，天津地區(qū)乳品廠A原料奶質(zhì)量相對較高，合格率達到60%，少數(shù)為超標奶。乳品廠B原料奶幾乎全部為超標奶，可能與采奶時間有關，分析原因可能采奶時間為夏季，此季節(jié)溫度較高，比較有利于微生物的繁殖。而且，乳品廠A比乳品廠B的生產(chǎn)規(guī)模大，奶源多為固定牧場提供，乳品廠B散奶戶較多，相對奶源質(zhì)量較參差不齊。山西地區(qū)奶源質(zhì)量較高，合格率也達到70%，且50%的奶樣菌落總數(shù)數(shù)量級僅為104，能達到國外標準，但仍存在部分超標奶，需要引起重視。

2.2 原料奶中大腸菌群數(shù)的測定

對3個地區(qū)的原料奶進行大腸菌群的檢驗，結(jié)果見表2。

表2 我國津晉地區(qū)原料奶樣品中大腸菌群檢出情況Table 2 Coliforms bacterial count in raw milk from Tianjin and Shanxi regions

大腸菌群是一種在37℃條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，來源于人體和溫血動物的糞便，它包括埃希氏菌屬(大腸桿菌)、肺炎克雷伯菌屬、檸檬酸桿菌屬和腸桿菌屬[20-21]。食品中大腸菌群的污染可用來判定食品被糞便污染程度，間接推斷食品中有無污染腸道致病菌(如志賀氏菌、沙門氏菌等)的可能[22]。目前，我國還沒有關于原料奶中大腸菌群數(shù)的控制標準，強制性國家標準GB 2746—1999《酸牛乳》[23]和GB 19302—2003《酸乳衛(wèi)生標準》[24]中規(guī)定，酸牛乳中大腸菌群數(shù)應小于或等于90MPN/100mL。從表2來看，山西地區(qū)原料奶直接或間接受糞便污染程度較小，最高大腸菌群數(shù)為110MPN/mL。天津地區(qū)受糞便污染程度差異較大，從15MPN/mL到大于11000MPN/mL。

總體來看山西地區(qū)原料奶質(zhì)量要優(yōu)于天津地區(qū)。這可能與其生產(chǎn)環(huán)境、加工人員、儲存運輸?shù)纫蛩赜嘘P。綜合分析可知，從天津和山西兩地區(qū)的自然環(huán)境和人文環(huán)境看，雖然天津地區(qū)自然環(huán)境比山西地區(qū)要好，但據(jù)取樣時的條件和乳品加工規(guī)模分析，山西地區(qū)的奶牛飼養(yǎng)區(qū)的衛(wèi)生情況較好，擠奶過程衛(wèi)生質(zhì)量規(guī)范，天津地區(qū)取樣的乳品廠A生產(chǎn)規(guī)模較大，奶源大多為固定牧場提供，質(zhì)量控制較好；而乳品廠B其生產(chǎn)規(guī)模相對較小，奶源供應者很多為散養(yǎng)戶，存在當?shù)啬剔r(nóng)衛(wèi)生意識差，手工擠奶過程不注重衛(wèi)生等情況，是造成天津地區(qū)原料奶污染較嚴重的主要原因。

2.3 原料奶中沙門氏菌的檢測及分析

2.3.1 沙門氏菌生化反應鑒定

通過增菌培養(yǎng)之后，從選擇性培養(yǎng)基上挑取可疑菌落，其中天津地區(qū)乳品廠A共挑取可疑菌株100株，乳品廠B共挑取97株，山西地區(qū)共挑取可疑菌株85株。經(jīng)過三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶等生化反應檢測，共有5株菌符合要求，其生化反應情況見表3。

表3 初步篩選所得沙門氏菌可疑菌株Table 3 Preliminary screening of suspicious Salmonella strains

以上5株可疑菌均符合生化反應初步鑒別表中反應序號A3的反應，需要補做ONPG實驗。經(jīng)鑒定，這5株菌均為ONPG陽性反應，可判定這5株菌均為非沙門氏菌。

2.3.2 沙門氏菌屬各生化群的鑒別

根據(jù)國標方法，進一步對可疑沙門氏菌進行生化群的鑒別。鑒別結(jié)果見表4。

表4 可疑沙門氏菌生化群鑒別結(jié)果Table 4 Biochemical characteristics of suspicious Salmonella strains

本實驗所采集的樣品數(shù)量較大，范圍較廣，檢驗采用了最新國家標準規(guī)定的方法，所以，實驗結(jié)果反映的情況對津晉地區(qū)原料奶中沙門氏菌的污染程度具有一定的代表性。經(jīng)過生化群的檢驗，可見這5株可疑菌均不符合生化分群結(jié)果，進一步判定所檢奶樣中無沙門氏菌，因此，可報告津晉地區(qū)原料奶中沙門氏菌未檢出。

從一定程度上說，津晉地區(qū)原料奶中致病菌污染程度不高，即使天津地區(qū)乳品廠B的奶源質(zhì)量較差，菌落總數(shù)幾乎都超標，但仍未檢出沙門氏菌，說明原料奶中菌落總數(shù)與沙門氏菌污染程度無直接對應關系。

3 結(jié) 論

3.1 原料奶的衛(wèi)生學指標分析

根據(jù)2008年最新頒布的國標方法，對我國天津和山西兩個地區(qū)的原料奶中菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)進行分析及鑒定。結(jié)果顯示：天津地區(qū)乳品廠A奶源質(zhì)量較好，菌落總數(shù)合格率達到60%；乳品廠B奶源質(zhì)量較差，幾乎均為超標奶；山西地區(qū)奶源質(zhì)量較好，菌落總數(shù)合格率也達到70%，且多數(shù)奶源菌落總數(shù)數(shù)量級為104；大腸菌群數(shù)兩個地區(qū)差異較大，山西地區(qū)受糞便污染程度較小，最高大腸菌群數(shù)僅為110MPN/mL；而天津地區(qū)的樣品大腸菌群從15MPM/mL至大于11000 MPN/mL均存在。

3.2 原料奶中沙門氏菌的檢測與鑒定

根據(jù)2008最新國標，對兩個地區(qū)3個乳品廠的原料奶進行增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)及一系列生化鑒定，結(jié)果均報告無沙門氏菌檢出。

4 展 望

原料奶位于乳業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的最上游，直接影響到乳品的質(zhì)量與安全。從這個意義上講，能否從源頭上緊抓原料奶的質(zhì)量控制，將直接關系到整個乳業(yè)的質(zhì)量安全。而據(jù)李勝利等[25]及黃艾祥等[26]的研究，中國目前雖然形成了一些大的乳品產(chǎn)業(yè)，有一些固定的規(guī)模化奶牛場，但散養(yǎng)戶占70%左右，對其衛(wèi)生指標監(jiān)控較低，且奶牛的飼料結(jié)構和質(zhì)量差，良種覆蓋率低，機械化擠奶效率低，約有80%的奶戶采取手工擠奶，奶牛防疫難，奶站缺乏規(guī)范化管理，我國奶業(yè)的發(fā)展與發(fā)達國家相比落后很多。因此，政府部門和企業(yè)需要協(xié)力引導和扶持奶農(nóng)以提高原料奶質(zhì)量和增加單產(chǎn)。

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Analysis and Identification on Contamination Status of Raw Milk in Tianjin and Shanxi Regions

GAO Wen-ru，CHEN Qing-sen*，YAN Ya-li，PANG Guang-chang，HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Salmonella is one of the most important gastrointestinal pathogens for human and animals. Approximately 70%－80% of bacterial food poisoning cases are caused by Salmonella in China. Therefore, food poisoning caused by Salmonella has become one of the most common and comparatively pernicious bacterial species. The contamination in raw milk from Tianjin and Shanxi regions in China was investigated by determining total bacterial count and coliform bacteria and Salmonella bacteria. The results indicated that the quality of raw milk from different sources in the two regions exhibited a great difference. The average total bacterial counts varied from 104CFU/mL to 107CFU/mL. Most of the tested samples could meet the quality standard and few of them were unqualified. However, coliforms bacterial count exhibited tremendous difference among samples from different sources. The quality of raw milk from Shanxi region was better than that from Tianjin region. The coliforms bacterial count was lower than 110 MPN/mL in the samples from Shanxi region. However, The coliforms bacterial count in the samples from Factory A were up to 1100 MPN/mL and from Factory B were no less than 11000 MPN/mL, respectively, although no Salmonella was detected. Therefore, the quality and safety issues of raw milk from the two regions can not be ignored.

raw milk；microorganism；total bacterial count；coliforms bacteria；Salmonella；contamination

TS252.1

A

1002-6630(2010)17-0351-04

2010-04-19

國家科技攻關計劃重大專題項目(2006BAD04A08)

高文茹(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)、乳品質(zhì)量與安全。

E-mail：gwr_2008@163.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術、蛋白資源開發(fā)與應用。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn