王文宗，李 琳，林鴻佳，陳 玲，李 冰*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

超聲波對多酚氧化酶酶活力的影響及其機理

王文宗，李 琳，林鴻佳，陳 玲，李 冰*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

以多酚氧化酶(PPO)為對象，研究不同超聲波條件對PPO酶活力的影響及其機理。結(jié)果表明：PPO酶活力隨著超聲時間增加而降低，隨著超聲波功率增大先略增大然后逐漸降低；在超聲波作用下PPO的穩(wěn)定溫度和pH值分別為40℃和6.8；經(jīng)超聲波處理后的PPO，其動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km增大、最大反應(yīng)速率Vmax減小；PPO二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角相對減少。

PPO；超聲波；酶活力

超聲波是一種頻率不小于20kHz的能量波，利用其振動能量，能在介質(zhì)中產(chǎn)生強大的剪切力和高溫，來改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能[1]，加速或減慢這些改變過程，可以由此引發(fā)或強化物理、化學(xué)、生物等過程，通過提高或降低這些過程的質(zhì)量和效率，達到其他處理技術(shù)難以達到的效果。隨著超聲波技術(shù)研究的不斷深入，超聲波技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于食品加工工業(yè)中[2-3]。近年來，食品中酶的超聲活化和鈍化成為研究熱點，超聲波對α-淀粉酶、糖化酶[4]、乙醛還原酶、溶菌酶[5]都有一定的抑制或激活的作用。

酶促褐變是果蔬汁加工、儲藏過程中普遍存在的一種現(xiàn)象，不僅會改變果汁的色澤、風(fēng)味，還會造成營養(yǎng)物質(zhì)的流失，嚴重影響了食品的感官和營養(yǎng)品質(zhì)。多酚氧化酶(polyphenel oxidase，PPO)是食品中引起酶促褐變的一種重要的酶。傳統(tǒng)抑制果蔬汁酶促褐變的方法主要是加熱處理、驅(qū)除氧氣和添加褐變抑制劑等，但這些傳統(tǒng)方法都存在一定的弊端。目前新興的抑制酶促褐變的方法主要是物理法包括高靜壓法、高強度脈沖電場法、超濾法等。國外已將高靜壓法應(yīng)用于果汁和果醬的生產(chǎn)，然而高靜壓法對設(shè)備的耐壓能力要求高，使其在食品行業(yè)中的應(yīng)用受到了很大的限制；國外對高強度脈沖電場法的研究已進入中試階段，國內(nèi)在這方面的研究尚屬于起步階段[6]；超濾法因其處理量小受到一定的限制。超聲波對酶促褐變的影響未查到相關(guān)報道。超聲波對酶作用是復(fù)雜的，既有抑制也有激活作用，這關(guān)鍵取決于超聲波作用的條件以及酶的種類，因此，通

過控制超聲作用條件，從而利用超聲波處理對酶的效應(yīng)來抑制果蔬汁的酶促褐變是可行的。通過超聲波對鮮榨蘋果汁進行處理，很大程度地降低了酶促褐變的速度，改善了果汁色澤，增強了果汁的穩(wěn)定性。

研究不同超聲波條件對PPO酶活力的影響程度以及影響機理，對抑制食品加工中酶促褐變具有重要的作用。因此，本研究以PPO為研究對象，研究超聲波作用下不同超聲波條件對PPO酶活力的影響，以及超聲波作用下PPO二級結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，從而闡明超聲波對引起褐變的酶的影響機制，為食品加工過程中酶促褐變的抑制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PPO(1460U/mg) 美國Sigma公司分裝；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 廣州精科玻璃儀器有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX500超聲波發(fā)生器 德國Sonics公司；UV-2102PC紫外分光光度計 上海尤尼柯有限公司；BS-300S精密電子天平 德國塞多利斯公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO酶活力的測定

采用分光光度計法，具體操作步驟參考Kruger等[7]的方法，并作部分修改。先將磷酸緩沖液、鄰苯二酚溶液及酶液分別放入30℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱15min，取1.6mL 0.1mol/L pH6.8的磷酸緩沖液、1.2mL 0.1mol/L鄰苯二酚及0.2mL酶液，混勻后立即在紫外分光光度計上于波長420nm處測定該混合體系的吸光度，同時開始計時。每隔1min記錄一次吸光度，連續(xù)記錄3min。按照同樣方法平行測定3次。

1.3.2 不同超聲波條件對PPO酶活力的研究

1.3.2.1 超聲波功率密度對PPO活性的影響

固定超聲波作用時間為4min，占空比為0.5(即超聲波作用2s，停止2s)，超聲波介質(zhì)pH6.8，超聲波介質(zhì)溫度為4℃，超聲波功率密度分別為0、5、10、40、65、95、135W/cm2。

1.3.2.2 超聲波作用時間對PPO活性的影響

固定超聲波功率密度為65W/cm2，占空比為0.5，超聲波介質(zhì)pH6.8，超聲波介質(zhì)溫度為4℃，超聲波作用時間分別選取0、2、4、6、8、10、12min。

1.3.2.3 超聲波介質(zhì)pH值對PPO活性的影響

固定超聲波功率密度為65W/cm2，超聲波作用時間為4min，占空比為0.5，超聲波介質(zhì)溫度為4℃，超聲波介質(zhì)pH值分別為3.5、6、6.8、7.4、8、9、10。

1.3.2.4 超聲波介質(zhì)溫度對PPO活性的影響

固定超聲波功率密度為65W/cm2，超聲波作用時間為4min，占空比為0.5，超聲波介質(zhì)pH值為6.8，超聲波介質(zhì)溫度分別為10、20、30、40、50、60℃。

1.3.3 PPO的動力學(xué)測定

采用不同濃度梯度的鄰苯二酚溶液，測定PPO的動力學(xué)，用Line weaver-Burk雙倒數(shù)作圖模型[8]分別求出無超聲波處理和經(jīng)超聲波處理(超聲波介質(zhì)溫度為40℃，超聲波介質(zhì)pH6.8，超聲波作用時間為4min，超聲波功率密度為65W/cm2)PPO的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。Km表示酶和底物之間的親和能力；Vmax是酶被底物飽和時的反應(yīng)速度。

1.3.4 PPO二級結(jié)構(gòu)的測定

稱取4mg PPO加入20mL 0.1mol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液，配成0.2mg/mL的PPO溶液經(jīng)超聲波處理(超聲波功率密度為65W/cm2，超聲波作用時間為4min，PPO溶液的溫度為40℃，pH6.8)，以0.1mol/L，pH6.8的磷酸緩沖溶液為空白溶液測定其圓二光譜。利用該圓二色光譜儀所配置的軟件包自動計算酶的二級結(jié)構(gòu)各組分的百分含量。對比樣品：0.2mg/mL的PPO溶液不經(jīng)超聲波作用直接測定其圓二光譜。

圓二色譜條件：掃描速度為100nm/min，帶寬1.0nm；掃描范圍190～250nm，重復(fù)掃描4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理條件對PPO酶活力的影響

2.1.1 超聲波功率密度對PPO酶活力的影響

圖1 超聲波功率密度對PPO酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the activity of PPO

由圖1可見，當(dāng)超聲波功率密度小于10W/cm2，隨著超聲波功率密度的增大，PPO酶活力略有升高；而超聲波功率密度大于10W/cm2，隨著超聲波功率密度的增大，其酶活力迅速降低。在超聲波功率密度為40W/cm2時，其活性為原酶液的90.2%；而當(dāng)超聲波功率密度增

大至135W/cm2時，其活性僅為原酶液的33.8%。說明低強度的超聲波對PPO有一定的激活作用，而高強度的超聲波則會抑制PPO活性。超聲波產(chǎn)生的機械傳質(zhì)作用和加熱作用增加了底物分子與酶分子的能量，使其運動性加強，相互間碰撞的概率增大，同時也加強了介質(zhì)與酶之間的傳質(zhì)擴散過程，超聲波作用下產(chǎn)生的振動的氣泡的周圍界面有利于介質(zhì)中的底物分子進入酶活性中心，也有利于產(chǎn)物分子進入介質(zhì)，從而提高了酶促反應(yīng)速度[9]。然而高強度超聲波處理酶溶液時會出現(xiàn)空化效應(yīng)，空化效應(yīng)瞬間產(chǎn)生高溫(大于5000K)、高壓(大于5×107Pa)、高能量密度沖擊波(可高達108N/m2)、微射流(速度達可400km/h)等極端物理作用[10]，而酶分子在強大的沖擊波或射流的作用下，分子結(jié)構(gòu)被破壞甚至被剪切成小碎片而表現(xiàn)出活力下降甚至失活[9]。這與文獻[11]所報道“隨著超聲功率的增加SOD活性先增大后減小”的結(jié)論一致。

最后，教師引入自變量與因變量、無關(guān)變量與額外變量的概念進行歸納總結(jié)。學(xué)生理解各類變量概念以及變量之間的關(guān)系，學(xué)會確定變量。

2.1.2 超聲波作用時間對PPO酶活力的影響

圖2 超聲波作用時間對PPO酶活力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic exposure time on the activity of PPO

由圖2可見，隨著超聲時間的增加，PPO酶活力呈現(xiàn)出下降的趨勢。PPO經(jīng)過6min的超聲波處理后，其活性顯著降低，活性為原酶液的42.5%。當(dāng)超聲處理時間超過6min時，隨著時間的增加酶活力雖仍有略微的下降，但變化幅度較小，說明超聲處理一定時間后，繼續(xù)延長超聲處理時間對PPO活性的影響較小。這與文獻[12]所報道的隨著超聲時間的增加胰蛋白酶活性變化規(guī)律一致。這可能是因為超聲波產(chǎn)生自由基和空化效應(yīng)使PPO的構(gòu)象產(chǎn)生了變化，從而使其酶活力在短時間內(nèi)迅速降低；但由于酶的結(jié)構(gòu)具有柔性，繼續(xù)延長超聲處理時間，對PPO結(jié)構(gòu)不會再有太大影響。

2.1.3 超聲波介質(zhì)pH值對PPO酶活力的影響

由圖3可見，當(dāng)介質(zhì)pH值為6.8時，PPO的活性最大，而一旦增加或減少介質(zhì)的pH值，使其偏離6.8后，均表現(xiàn)出酶活力的下降。這說明超聲波作用下PPO的穩(wěn)定pH值為6.8左右，這與圖3中無超聲波作用下PPO穩(wěn)定pH值為6.8，基本一致，由此可知，超聲波作用并沒有影響PPO的穩(wěn)定pH值條件。

圖3 超聲波作用下pH值對PPO酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of PPO with ultrasonic exposure

2.1.4 超聲波介質(zhì)溫度對PPO酶活力的影響

圖4 超聲波作用下溫度對PPO酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of PPO with ultrasonic exposure

由圖4可知，當(dāng)溫度為40℃時，PPO的酶活力最大；而低于40℃或高于40℃時，均表現(xiàn)為酶活力的下降；在溫度為60℃時，PPO的活性基本消失。這說明PPO的酶活力最高溫度為40℃左右，溫度過低時，會使酶的活性受到抑制；而溫度過高則會破壞酶的空間構(gòu)象，造成酶的失活。無超聲波作用的PPO的穩(wěn)定溫度為40℃，與經(jīng)過超聲波作用的PPO的酶穩(wěn)定溫度完全一致。由此可知，超聲波并沒有影響酶的穩(wěn)定溫度條件。

圖5 無超聲波作用下和經(jīng)過超聲波作用PPO酶活力動力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curves of PPO with and without ultrasonic exposure

由表1得知，無超聲波作用的PPO的Km=0.94×10-2mol/L，Vmax=0.8652ΔA/min；經(jīng)超聲波作用的PPO的

Km=1.09×10-2mol/L，Vmax=0.7638ΔA/min。可以看出，經(jīng)過超聲波作用后的PPO的米氏常數(shù)Km有所增大，最大反應(yīng)速率Vmax有所減小，這表明超聲波作用使PPO與底物的親和力減弱了。由于米氏常數(shù)只與酶的性質(zhì)有關(guān)，在較高強度的超聲作用下，酶分子的能量進一步加大，構(gòu)象進一步改變，趨向不合理的構(gòu)象，導(dǎo)致酶分子本身的催化活力受到阻礙[9]。因此，可推測超聲波作用改變了PPO活性中心的結(jié)構(gòu)或者是酶的構(gòu)像，從而導(dǎo)致其與底物親和力的改變。

表1 無超聲波作用和經(jīng)過超聲波作用的PPO酶活力動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of PPO with and without ultrasonic exposure

2.3 超聲波對PPO二級結(jié)構(gòu)的影響

圖6 無超聲波作用與經(jīng)過超聲波作用PPO的圓二色譜圖Fig.6 CD spectra of PPO with and without ultrasonic exposure

表2 PPO圓二色譜的分析結(jié)果Table 2 CD spectral data of PPO with and without ultrasonic exposure %

由表1可以看出，經(jīng)超聲波作用后PPO蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)略有減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)減少了4.2%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加了約6.4%。蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部的氫鍵。在酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊是維系其空間結(jié)構(gòu)的骨架結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，導(dǎo)致規(guī)則二級結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性和剛性；β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲中氫鍵作用微弱，使肽段中的各個殘基間有更大的自由度[13]，因此，超聲波產(chǎn)生強大的沖擊波或射流[9]對β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氫鍵影響較大，導(dǎo)致對PPO二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)破壞較大。

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，采用不同條件的超聲波處理，可以不同程度抑制PPO的酶活力。隨著超聲波功率的增大，PPO酶活力先略有升高，然后逐漸降低；PPO酶活力隨著超聲波作用時間的增大逐漸減小，而單一延長超聲波處理的總時間，對PPO酶活力的影響較小。超聲后的PPO的動力學(xué)參數(shù)Km增大、Vmax減少。通過圓二色譜分析可以看出，超聲波是通過改變酶分子的結(jié)構(gòu)進而影響其活性的。當(dāng)超聲波作用于酶溶液時，超聲波釋放的能量作用于酶分子，可能導(dǎo)致維持二級結(jié)構(gòu)的氫鍵的斷裂，導(dǎo)致部分構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致酶分子的構(gòu)象趨于不合理，從而影響酶活力，抑制酶促反應(yīng)。

[1] SORIA A C, VILLAMIEL M. Effect of ultrasound on the technological properties and bioactivity of food: A review[J]. Trends in Food Science & Technology, 2010, 21(7): 323-331.

[2] de la FUENTE-BLANCO S, RIERA-FRANCO de SARABIA E, ACOSTA-APARICIO V M, et al. Food drying process by power ultrasound[J]. Ultrasonics, 2006, 44(1): 523-527.

[3] VILKHU K, MAWSON R, SIMONS L, et al. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry: A review [J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2008, 9(2): 161-169.

[4] BARTON S, BULLOCK C, WEIR D. The effects of ultrasound on the activities of some glycosidase enzymes of industrial importance[J]. Enzyme Microb Technol, 1996, 18(3): 190-194.

[5] COAKLEY W T, BROWN R C, JAMES C J, et al. The inactivation of enzymes by ultrasonic cavitation at 20 kHz[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, 159(2): 722-729.

[6] 唐貴芳, 趙秋艷, 喬明武, 等. 蘋果汁酶促褐變抑制方法的比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2008, 24(10): 122-126.

[7] KRUGER J E, HATCHER D W, DEPAUW R. A whole seed assay for poly-phenol oxidase in canadian prairie spring wheats and its usefulness as a measure of nodle darkening[J]. Cereal Chem, 1994, 71(4): 324-326.

[8] LINEWEAVER H, BURK D. The determination of enzyme dissociation constants[J]. J Amer Chem Soc, 1934, 56: 658-666.

[9] 呂鵬, 莊重, 凌建亞, 等. 超聲對酶的影響[J]. 生物技術(shù)通訊, 2004, 15(5): 534-536.

[10] GONG C L, HART D P. Ultrasound induced cavitation and sonochemical yields[J]. Journal of Acoustical Society of American, 1998, 104(5): 2675-2682.

[11] 錢春梅, 譚兆贊, 李云, 等. 超聲波對菜豆種子超氧化物歧化酶活性的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2004, 25(3): 73-77.

[12] TIAN Zhongmin, WAN Mingxi, WANG Supin, et al. Effects of ultrasound and additives on the function and structure of trypsin[J]. Ultrasonic Sonochemistry, 2004, 11(6): 399-404.

[13] 閻隆飛, 孫之榮. 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 1999: 36-37.

Effect and Mechanisms of Ultrasonic Treatment on Polyphenol Oxidase Activity

WANG Wen-zong，LI Lin，LIN Hong-jia，CHEN Ling，LI Bing*
(College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effects of different ultrasonic treatment conditions on polyphenol oxidase (PPO) activity were investigated. Meanwhile, related mechanisms were explored. The results indicated that with prolonged ultrasonic treatment time, PPO activity initially increased, followed by a decrease. Higher ultrasonic power resulted in a slight increase followed by a gradual decrease. The stable temperature and pH for PPO treated by ultrasonic were respectively 40 ℃ and 6.8, respectively. After ultrasonic treatment, an increase in the Kmof PPO and a decrease in its Vmaxwere simultaneously observed, and the content of β-turn secondary structures decreased.

polyphenol oxidase；ultrasonic；enzyme activity

TS255.44

A

1002-6630(2010)17-0331-04

2010-06-29

國家“863”計劃重點項目(2007AA100405)；廣東省教育廳產(chǎn)學(xué)研基地科技成果轉(zhuǎn)化重大項目(cgzhzd0704)；科技部國際科技合作計劃項目(2009DFA32070)

王文宗(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為糖類物質(zhì)及其藥物的制備與生物利用。

E-mail：wangwenzong@126.com

*通信作者：李冰(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為糖類物質(zhì)及其藥物的制備與生物利用。

E-mail：bli@scut.edu.cn