李維煥，蔡德華，鄭 芳，馬茜楠，楊樹德，高興喜

(魯東大學菌物科學與技術(shù)研究院，山東 煙臺 264025)

秀珍菇菌株的親緣關(guān)系分析

李維煥，蔡德華，鄭 芳，馬茜楠，楊樹德，高興喜

(魯東大學菌物科學與技術(shù)研究院，山東 煙臺 264025)

采用ERIC-PCR技術(shù)對12株秀珍菇菌株的親緣關(guān)系進行分析，并與拮抗實驗和酯酶同工酶實驗進行對比。結(jié)果表明：在12株秀珍菇菌株中，ERIC-PCR擴增出的條帶清晰，重復(fù)性好，多態(tài)性高。PCR產(chǎn)物大致在150～3500bp范圍內(nèi)，各菌株擴增條帶數(shù)在9～16條之間。聚類分析表明，在79%的分類水平上，12個菌株聚成4組。MY灰和MY白菌株親緣關(guān)系較近，聚為第1組；HZ845為第2組；HZ3、HZ5和HZ夏親緣關(guān)系很近，聚為第3組；LD1、GY16、GY18、GY163、SM、XY秀1親緣關(guān)系很近，聚為第4組。ERIC-PCR聚類分析結(jié)果與拮抗實驗和酯酶同工酶分析結(jié)果基本一致，驗證了ERIC-PCR技術(shù)的可靠性。

ERIC-PCR技術(shù)；拮抗實驗；酯酶同工酶；秀珍菇；親緣關(guān)系

秀珍菇(Pleurotus pulmonarius Fr. Quel)[1]隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌目(Agaricales)、側(cè)耳科(Pleurotaceae)、側(cè)耳屬(Pleurotus)[2]。秀珍菇因其外形悅目、鮮嫩可口、營養(yǎng)豐富、口感清脆、個體嬌美、珍貴而聞名[3]，近年來逐漸成為栽培面積最廣的珍稀食用菌之一，產(chǎn)品暢銷國內(nèi)外。

ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)是Sharples等[4]首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種腸桿菌基因間共有重復(fù)序列。其中心存在高度保守的、長約44bp的核心序列[5]。不同種屬個體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，可進行指紋圖譜分析。ERICPCR的原理是利用根據(jù)ERIC核心序列設(shè)計的反向引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小在50～3000bp之間，根據(jù)所得數(shù)目不等、大小不同的各自獨特的電泳帶型來達到菌株分型的目的[6]。ERIC-PCR技術(shù)不僅可以用于含ERIC序列的細菌的分類與鑒定、菌株親緣關(guān)系鑒定等研究[7]，而且Gillings等[8]用該技術(shù)從噬菌體、真菌、植物及動物的基因組DNA中也擴增出相應(yīng)的特征性產(chǎn)物，但這些供試的基因組DNA中并未發(fā)現(xiàn)ERIC序列，因而ERICPCR方法是一種特殊的隨機擴增。近來，ERIC-PCR以其操作簡便易實現(xiàn)、重復(fù)性高、分辨力強等優(yōu)點，已被用于食用菌，如木耳[9]、紫木耳[10]、靈芝[11]和平菇[12]

的菌株鑒定和遺傳多樣性分析。但尚未見ERIC-PCR技術(shù)應(yīng)用于秀珍菇菌株親緣關(guān)系分析的報道。

由于我國食用菌菌種登記制度不完善，菌種混亂現(xiàn)象較為普遍，秀珍菇同樣如此，同名異物，同物異名現(xiàn)象嚴重，這些現(xiàn)象對秀珍菇規(guī)?；a(chǎn)和育種實踐是不利的。為了研究、交流和貿(mào)易的方便，有必要對現(xiàn)有栽培品種的親緣關(guān)系進行分析。本實驗將ERIC-PCR技術(shù)應(yīng)用于秀珍菇菌株的親緣關(guān)系分析，并與傳統(tǒng)的鑒定方法拮抗實驗和酯酶同工酶實驗進行對比，驗證ERIC-PCR技術(shù)的可行性，旨在為簡單快速鑒定秀珍菇栽培菌株，秀珍菇生產(chǎn)和育種親本的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

魯大秀珍1號(LD1)由魯東大學菌物科學與技術(shù)研究院提供；高郵秀珍菇18號(GY18)、高郵秀珍菇16號(GY16)、高郵秀珍菇163號(GY163)由江蘇高郵食用菌研究所提供；華中秀珍菇3號(HZ3)、華中秀珍菇5號(HZ5)、華中夏秀靈(HZ夏)、華中秀珍菇845號(HZ845)由華中農(nóng)業(yè)大學菌種實驗中心提供；綿陽灰色秀珍菇(MY灰)、綿陽白色秀珍菇(MY白)由四川綿陽食用菌研究所提供；三明秀珍菇(SM)由福建三明真菌研究所提供；新宇秀麗1號(XY秀1)由湖北武漢新宇食用菌研究所提供。

采用PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[13]：馬鈴薯200g、蔗糖(或葡萄糖) 20g、瓊脂15g，水1000mL，pH值自然，121℃滅菌20min。

1.1.3 試劑

Taq酶、10×PCR緩沖液、MgCl2和dNTP 寶生物工程(大連)有限公司；Rnase A Promega 公司；DNA Marker III 天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑為普通分析純。

1.2 方法

1.2.1 ERIC-PCR

1.2.1.1 基因組DNA的提取

用前將保存的供試菌株接種PDA斜面25℃活化培養(yǎng)，活化好后接種到PDA固體平板，25℃培養(yǎng)5～7d，用鑷子小心刮取菌絲，存于－20℃?zhèn)溆谩２捎梦墨I[12]報道的CTAB方法提取供試菌株菌絲體基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 ERIC-PCR引物

選擇ERIC2和ERICR這對引物進行ERIC-PCR反應(yīng)，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列[10]如下：ERIC2：5＇-AAGTAAGTGACTGG GGTGAGCG-3＇，ERICR：5＇-ATGTAAGCTCCTGG GGATTCAC-3＇。

1.2.1.3 ERIC-PCR反應(yīng)體系

優(yōu)化后的ERIC-PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，包含10×PCR緩沖液2.5μL、Mg2+(2.5 mmol/L)1.5μL、dNTP (各2.5mmol/L)2.0μL、引物(20μmol/L) 1.0μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL、DNA模板25ng，用ddH2O補齊到25μL。陰性對照為ddH2O。

1.2.1.4 ERIC-PCR反應(yīng)程序

對退火溫度進行多次實驗，最終確定為44℃擴增效果最佳。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，44℃退火45s，72℃延伸2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.1.5 ERIC-PCR擴增結(jié)果檢測

配制1.2%瓊脂糖凝膠(含5μg/mL EB)，取10μL擴增產(chǎn)物與2μL 6×Loading buffer混勻加入樣品孔后電泳，保持電壓在100～120V之間(最高電壓不超過5V/cm)。電泳結(jié)束后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，觀察實驗結(jié)果。

1.2.1.6 聚類分析

將PCR擴增產(chǎn)物中分子質(zhì)量量不同的DNA條帶視為多態(tài)性狀，分子質(zhì)量量相同的條帶作為1個相同性狀，有條帶記為1，無條帶記為0。分析記錄重復(fù)性好且穩(wěn)定的擴增條帶，無規(guī)律出現(xiàn)的弱帶不予紀錄。采用SLT_NTsys_2.10e軟件計算各菌株間的相似性系數(shù)，然后進行聚類分析。

1.2.2 拮抗實驗

將不同菌株活化后，在同一平板上按品字形接種3株菌株，25℃培養(yǎng)5～7d，觀察菌絲間的拮抗反應(yīng)情況。

1.2.3 酯酶同工酶分析

1.2.3.1 酶粗提取液的制備

在PDA液體培養(yǎng)基上接種供試菌株， 25℃ 靜置培養(yǎng)10d。稱取0.5g菌絲體，加液氮研磨；轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入1.0mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)，充分混勻；4℃，8000r/min離心20min，上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5mL離心管中，放入－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 電泳[14]

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠質(zhì)量濃度為2.5g/100mL (pH6.7)，分離膠質(zhì)量濃度為7g/100mL (pH8.9)，電極緩沖液采用Tris-Gly pH8.3系統(tǒng)，酶液加樣量為50μL。 在4℃冰箱中，開始以20mA的電流進

行恒流電泳，待樣品進入分離膠后，將電流升至50mA進行恒流電泳；待溴酚藍遷移至平板下端約0.5～1cm 處停止電泳。

1.2.3.3 染色[15]

將電泳后的凝膠浸入染色液(α-β-醋酸萘酯和堅牢藍RR配制 )中，37℃染色10～15min，待顯示出清晰酶帶，用蒸餾水漂洗，直接照相。

1.2.3.4 聚類分析

同ERIC-PCR，將遷移率不同的同工酶譜帶視為多態(tài)性狀，遷移率相同的條帶作為1個相同性狀，有條帶記為1，無條帶記為0。采用SLT_NTsys_2.10e軟件計算各菌株間的相似性系數(shù)，然后進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERIC-PCR分析

2.1.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法提取12株秀珍菇的基因組DNA，其電泳結(jié)果表明，每個樣品DNA都有1條清晰的條帶，拖尾現(xiàn)象很弱，說明提取的DNA完整性好、純度高，可用于ERIC-PCR擴增。

2.1.2 供試菌株的ERIC-PCR分析

ERIC引物對12個菌株進行PCR擴增，得到了具有高重復(fù)性的清晰的電泳圖譜，如圖1所示。

由圖1可見，12個菌株共擴增出35種、143條DNA條帶，表現(xiàn)出很好的DNA多態(tài)性。擴增的DNA條帶大小大致在150～3500bp范圍內(nèi)，最大的條帶出現(xiàn)在9號(MY灰)菌株，最小的條帶出現(xiàn)在12號(XY秀1)菌株。各菌株擴增條帶數(shù)在9～16條。其中，9號(MY灰)菌株擴增條帶最多，為16條；6號(HZ5)菌株擴增條帶最少，為9條。5號(HZ3)、6號(HZ5)和7號(HZ夏)菌株有約190、400、700bp的3條其他菌株沒有的特征條帶；9號(MY灰)和10號(MY白)菌株與其他菌株相同的條帶少，說明這兩個菌株與其他10個菌株遺傳差異較大；8號(HZ845)菌株在2000bp左右擴增條帶較多，且?guī)酮毺?；LD1、GY16、GY18、GY163、SM和XY秀1六個菌株擴增帶型相似。3號(GY16)和11號(SM)菌株擴增帶型完全相同。

2.1.3 秀珍菇菌株擴增結(jié)果的聚類分析

利用SLT_NTsys_2.10e軟件對擴增結(jié)果進行聚類分析，得到圖2所示樹狀聚類圖。

圖2 ERIC-PCR電泳圖譜樹狀聚類圖Fig.2 Cluster analysis dendrogram of P. pulmonarius strains based on ERIC-PCR fingerprints

由圖2可見，在79%的分類水平上，ERIC-PCR技術(shù)可將12個供試菌株分為4組。MY灰和MY白菌株親緣關(guān)系較近，相似性達80%，聚為第1組；HZ845為第2組；HZ3、 HZ5和HZ夏三株菌株相似性達90%，親緣關(guān)系很近，聚為第3組；LD1、GY16、GY18、GY163、SM和XY秀1 六株菌株相似性也達90%，親緣關(guān)系很近，聚為第4組。第3組和第4組菌株親緣關(guān)系較近，在78%的分類水平上即可聚為一組；HZ845與第3組和第4組菌株的親緣關(guān)系又遠了一些，需在64%的分類水平上才能相遇；而MY灰和MY白菌株與其他菌株僅有50%的相似性，親緣關(guān)系較遠。GY16和SM菌株相似性為100%，推測其可能是同物異名菌株。

2.2 拮抗實驗

表1 秀珍菇菌株拮抗實驗結(jié)果Table 1 Antagonistic test of P. pulmonarius strains

秀珍菇12株菌株間均產(chǎn)生拮抗線，由此說明12株秀珍菇菌株間均存在體細胞不親和性。拮抗線有的明顯，有的不明顯，表明親緣關(guān)系遠近存在一的差異。根據(jù)親緣關(guān)系遠近可將這12株菌株分為4組，LD1、GY16、GY18、GY163、SM和XY秀1 為一組，HZ3、HZ5和HZ夏為一組，MY灰和MY白為一組，HZ845菌株為一組。

2.3 酯酶同工酶實驗

這12株菌株酯酶同工酶有十分豐富的表達，共檢測出25條酶帶(圖3)。利用SLT_NTsys_2.10e軟件對酯酶同工酶譜進行聚類分析，得到如圖4所示樹狀聚類圖。在82%的分類水平上，可將12個供試菌株分為4組。MY灰和MY白二者之間酶譜差異小，但與其他10個菌株差別很大，這兩株菌株聚為第1組；Rf=0.63和Rf=0.82的這兩條酶帶為HZ845菌株所特有，且活性較強，HZ845為第2組；HZ3、 HZ5和HZ夏三株菌株為第3組，Rf=0.70的這條酶帶是這3株菌株的特征條帶；LD1、GY16、GY18、GY163、SM和XY秀1 六株菌株聚為第4組，除GY163外，其余5株菌株均有Rf=0.60的這條酶帶。

圖3 12株秀珍菇菌株的酯酶同工酶譜Fig.3 Esterase isozyme patterns in 12 P. pulmonarius strains

圖4 酯酶同工酶譜樹狀聚類圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram of P. pulmonarius strains based on esterase isozyme patterns

3 討 論

菌種作為食用菌最重要的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料，其收集、保存、遺傳多樣性評價以及利用，已成為遺傳育種領(lǐng)域中一個重要的研究方向。遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，遺傳多樣性水平代表了一個物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度，是物種適應(yīng)和進化的遺傳基礎(chǔ)。多樣性的分析對了解物種的適應(yīng)性、物種起源和基因資源的分布及育種親本的選擇等具有重要意義[16]。分析種內(nèi)的遺傳多樣性，分子標記是一種非常有效的方法[17]。RAPD、RFLP、IGS、ISSR和SCAR標記已廣泛用于白靈菇、香菇、雙孢蘑菇等真菌的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析[17-19]。對秀珍菇而言，已見RAPD[2,20]、ESTSSR[2]、ITS-RFLP[3]和SRAP[21]等標記的應(yīng)用。

本研究用ERIC-PCR技術(shù)對12株秀珍菇菌株的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進行分析，成功將12株菌株在79%的分類水平上分為4組，與拮抗實驗和同工酶分析的結(jié)果基本一致，說明ERIC-PCR技術(shù)的可行性。聚類分析結(jié)果表明，來自同一地區(qū)的供試秀珍菇菌株聚為一類，也有少數(shù)菌株和其他地區(qū)菌株聚在一起，這與忻雅等[2]用RAPD和EST-SSR分析的結(jié)果一致。也說明我國秀珍菇栽培菌株引種頻繁，存在穿插引種現(xiàn)象。HZ3、HZ5和HZ夏與GY16、GY18、GY163、SM和XY秀1六株菌株親緣關(guān)系較近，而與來自同一地區(qū)的HZ845遺傳差異較大，可能是因為HZ845菌株是低溫品種，其他菌株均為中、高溫型菌株。ERIC-PCR結(jié)果顯示GY16和SM菌株相似性為100%，可能為相同菌株，但二者之間有弱的拮抗線、酯酶同工酶譜不完全相同、而且子實體形態(tài)上也略有差異。表明ERIC-PCR技術(shù)有一定的局限性，對于差異性很小的菌株無法區(qū)分。實際上，包括分子生物學技術(shù)在內(nèi)的任何單一技術(shù)，都具有應(yīng)用上的局限性，食用菌鑒定需要用多項技術(shù)綜合分析。

ERIC-PCR方法對于真菌來說可能是一種特殊的隨機擴增，但是由于ERIC- PCR擴增引物較長(22bp)，因此相對于隨機擴增分析技術(shù)RAPD來說，PCR反應(yīng)退火溫度較高，可產(chǎn)生較高重復(fù)性和一定特異性的DNA指紋圖譜。另外，與其他傳統(tǒng)方法，如拮抗實驗、同工酶實驗相比，ERIC-PCR方法簡便、快捷、省時省力、節(jié)約成本。ERIC-PCR擴增時對于退火溫度非常敏感，本實驗用44℃擴增結(jié)果最佳。因此，實驗時優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，進行多次擴增，選擇重現(xiàn)性好的條帶用于分析，是該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。

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Analysis of the Phylogenetic Relationships of Pleurotus pulmonarius Strains

LI Wei-huan，CAI De-hua，ZHENG Fang，MA Qian-nan，YANG Shu-de，GAO Xing-xi
(Institute of Mycological Science and Technology, Ludong University, Yantai 264025, China)

ERIC-PCR technique was used to analyze the phylogenetic relationships among 12 kinds of Pleurotus pulmonarius strains. The results indicated that the amplified product bands of ERIC-PCR were mainly distributed in a range from 150 to 3500 bp with good reproducibility and high polymorphism. The number of amplified bands varied from 9 to 16 for each strain. Cluster analysis revealed 79% similarity and 4 distinctive clusters among 12 strains. Based on the close phylogenetic relationship, MY Gray and MY White were designated as the first cluster, and HZ845 was designated as the second cluster, and the third cluster included HZ3, HZ5 and HZ Xia, and the fourth cluster included LD1, GY16, GY18, GY163, SM and XY-Xiu1. Meanwhile, the third cluster and the fourth cluster exhibited much closer phylogenetic relationship. The tested phylogenetic relationships among P. pulmonarius strains by ERIC-PCR were consistent with the results from antagonistic test and isozyme analysis of esterase. Therefore, ERIC-PCR is reliable in the identification of P. pulmonarius strains.

ERIC-PCR technique；antagonistic test；esterase isozyme；Pleurotus pulmonarius；phylogenetic relationship

S646.1

A

1002-6630(2010)17-0267-05

2010-05-12

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BADA1B04)；山東省“泰山學者”建設(shè)工程專項經(jīng)費項目(魯發(fā)[2003]20號)；魯東大學引進人才博士基金項目(LY2010003)

李維煥(1979—)，女，講師，博士，研究方向為食用菌生理及栽培。E-mail：lwh1979@163.com