金 劍，康文麗，生吉萍，程凡升，王權(quán)帥，張焱鑫，張國鵬，申 琳*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

云芝(Coriolus versicolor)木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)酶學(xué)性質(zhì)分析

金 劍，康文麗，生吉萍，程凡升，王權(quán)帥，張焱鑫，張國鵬，申 琳*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

研究云芝(Coriolus versicolor)產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)酶活力隨時(shí)間的變化情況，以及溫度、pH值、金屬離子及化合物對云芝LiP酶活力和穩(wěn)定性的影響，對該酶底物濃度效應(yīng)和Km值進(jìn)行測定。結(jié)果表明：云芝培養(yǎng)12d，其酶活力最高，為72U/mL。該酶的最適溫度為40℃，在30～40℃范圍內(nèi)穩(wěn)定；最適pH值為2.5，pH值在2.0～3.5較穩(wěn)定；Zn2+對LiP有激活作用，Na+對酶活力沒有影響，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Cu2+及EDTA、SDS、β-巰基乙醇都表現(xiàn)出抑制作用；Km值為2.05×10-4mol/L。

云芝；木質(zhì)素過氧化物酶；溫度；pH值；Km

木質(zhì)素是植物細(xì)胞中的主要成分之一，在食品工業(yè)副產(chǎn)物以及食品工業(yè)廢渣中含有大量的木質(zhì)素。自然界中，其數(shù)量僅次于纖維素，是潛力巨大的碳素資源，它主要是由不均勻、不規(guī)則的苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成的芳香族高聚體。木質(zhì)素和纖維素、半纖維素相互鑲嵌、相互黏合組成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，緊密結(jié)合細(xì)胞壁其他成分[1]。由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜穩(wěn)定，難于降解，成為自然界碳素循環(huán)的限速步驟[2]，因此，對木質(zhì)素的生物降解成為當(dāng)今世界在生物質(zhì)能源的開發(fā)利用和環(huán)境污染控制方面的研究熱點(diǎn)[3]。

木質(zhì)素降解酶系[4]主要是木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、漆酶(laccase)和錳過氧化物酶(Mnperoxidase，MnP)。其中LiP主要是由真菌分泌，含有亞鐵血紅素輔基的糖基化蛋白酶，其最早是Kirk等[5]于1983年從黃孢原毛平革菌中發(fā)現(xiàn)，后來在多種白腐真菌中也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，其在生物制漿、有機(jī)污染物的降解以及環(huán)境污染控制等方面發(fā)揮重要作用[6-8]。由于LiP對底物沒有特異性要求，其在食品加工過程中，如果汁澄清以及食品工業(yè)副產(chǎn)物的綜合利用和食品工業(yè)廢渣廢液處理等方面應(yīng)用潛力巨大。

云芝又稱彩云革蓋菌，別名雜色云芝(Coriolus versicolor)，是多孔菌科真菌云芝屬的子實(shí)體[9]，其次

生代謝過程中能產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶系。本實(shí)驗(yàn)研究云芝LiP的酶學(xué)性質(zhì)，對云芝的開發(fā)利用和LiP的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

云芝菌種購買于中國農(nóng)業(yè)菌種保藏中心(ACCC 50435)。

PDA培養(yǎng)基用于菌種活化；高碳低氮[10]培養(yǎng)基用于產(chǎn)酶：每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20.0g、氯化銨0.3g、KH2PO44.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl20.3g、藜蘆醇0.182g。

1.2 試劑

天青B、藜蘆醇 美國Sigma公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計(jì)(配有UNICO分光光度計(jì)應(yīng)用軟件) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科技有限公司；PB-10 pH計(jì) 德國Sartorius公司。

1.4 方法

1.4.1 云芝LiP的培養(yǎng)方法和酶液制備

在250mL三角瓶中放入30mL產(chǎn)酶的培養(yǎng)基，接種直徑為8mm的云芝菌塊，于28℃、170r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。取培養(yǎng)液，于4℃、10000r/min離心10min，取上清液為粗酶液，－80℃保存待用。

1.4.2 云芝LiP酶活力測定

反應(yīng)體系中含酶液0.5mL，4mmol/L藜蘆醇0.4mL，酒石酸緩沖液2.0mL(pH2.5)，于30℃條件下加入0.1mL 15mmol/L的雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)，于310nm波長處測定反應(yīng)最初3min內(nèi)的吸光度變化[11]。

酶活力定義為：30℃時(shí)每分鐘使1μmol的藜蘆醇轉(zhuǎn)化為藜蘆醛所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對云芝LiP酶活力的影響

在250mL三角瓶中放入30mL產(chǎn)酶的培養(yǎng)基，接種直徑為8mm的云芝菌塊，于28℃、170r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每2d取樣，測定不同時(shí)間云芝LiP的酶活力。

1.4.4 云芝LiP最適溫度的選擇

分別將酶液置于20、30、40、50、60℃，測定各溫度下的酶活力，以酶活力最高者計(jì)算相對酶活力。

1.4.5 云芝LiP溫度穩(wěn)定性研究

分別將酶液置于20、30、40、50、60℃條件下保溫2h，測定各溫度下的酶活力，以各溫度最初酶活力計(jì)算相對剩余酶活力。

1.4.6 云芝LiP最適pH值的選擇

將酶活力測定方法中的緩沖液改用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，取適量酶液置于pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，測定各pH值下的酶活力，以酶活力最高者計(jì)算相對酶活力。

1.4.7 云芝LiP的pH值穩(wěn)定性研究

在1.4.6節(jié)條件下，將酶液置于pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0條件下，于30℃保持4h，測定各pH值下的酶活力，以不同pH值條件下最初酶活力計(jì)算相對剩余酶活力。

1.4.8 金屬離子及化合物對云芝LiP的影響

在酶液中分別加入EDTA、SDS、β-巰基乙醇、CaCl2、KCl、MgCl2、MnCl2、NaCl、CuCl2、ZnCl2至終濃度為5mmol/L，于30℃保持30min，以未添加金屬離子及化合物的酶液為對照，測定各種金屬離子及化合物下的酶活力，以未添加金屬及化合物離子及化合物酶液的酶活力計(jì)算其相對剩余酶活力。

1.4.9 底物濃度效應(yīng)

以天青B為底物，分別配制不同濃度的底物，使之與酶液反應(yīng)，測定酶反應(yīng)速度。用雙倒數(shù)作圖法求出酶對該底物的Km值。

1.5 相對酶活力和相對剩余酶活力的計(jì)算

式中：1.4.4、1.4.6節(jié)方法中，A為各溫度或pH值下的酶活力；B為各溫度或pH值下的最高酶活力。

式中：1.4.5、1.4.7、1.4.8節(jié)方法中，C為各溫度、pH值以及金屬離子處理一段時(shí)間后的酶活力；D為各溫度、pH值以及未添加離子處理時(shí)的最初酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對云芝LiP酶活力的影響

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對云芝LiP酶活力的影響Fig.1 Effect of incubation time on LiP production

如圖1所示，云芝在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上隨著時(shí)間的變化，產(chǎn)酶量不同。在第12天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，為72U/mL。故選取第12天的發(fā)酵液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 溫度對云芝LiP酶活力的影響

圖2 溫度對云芝LiP酶活力的影響Fig.2 Effect of incubation temperature on LiP production

如圖2所示，LiP對溫度比較敏感，在30～40℃之間有較高的活力，40℃時(shí)酶活力最高。而在其他作用溫度下酶活力較低，20℃時(shí)酶活力是40℃時(shí)的46%，50℃時(shí)的酶活力是40℃時(shí)的56%。

2.3 云芝LiP的熱穩(wěn)定性

圖3 云芝LiP的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of LiP from C. versicolor

如圖3所示，云芝LiP在低溫下穩(wěn)定，20、30、40℃條件下保持2h，其酶活力基本不下降。當(dāng)溫度高于40℃時(shí)酶活力迅速下降，在50℃保持2h后，其相對剩余酶活力為63%，而在60℃時(shí)保持2h后，其相對剩余酶活力僅7%。

2.4 pH值對云芝LiP酶活力的影響

圖4 pH值對云芝LiP酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of LiP from C. versicolor

如圖4所示，LiP在強(qiáng)酸性條件下酶活力較高，最適pH值為2.5，在pH值大于3.5時(shí)酶活力迅速下降，在pH值為5.0時(shí)，其相對酶活力為19%。

2.5 云芝LiP的pH值穩(wěn)定性

圖5 云芝LiP云芝的pH值穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of LiP from C. versicolor

由圖5可知，云芝LiP在不同pH值條件下30℃保溫4h，酶活力都有明顯下降。在pH2.0～3.5范圍內(nèi)其相對酶活力相對穩(wěn)定，相對剩余酶活力在50%以上。在pH值大于4.0時(shí)，相對剩余酶活力下降迅速，在pH值大于5.0時(shí)，已經(jīng)檢測不到剩余酶活力。

2.6 金屬離子及化合物對云芝LiP酶活力的影響

圖6 不同金屬離子及化合物對云芝LiP的影響Fig.6 Effects of metal ions and compounds on the activity of LiP from C. versicolor

如圖6所示，金屬離子及化合物對LiP有明顯的激活或抑制作用。當(dāng)離子濃度為5mmol/L時(shí)，只有Zn2+表現(xiàn)出激活作用，酶活力提高了20%；Na+對酶活力沒有影響；其他金屬離子及化合物均表現(xiàn)出抑制作用，其中，Mg2+作用下的剩余相對酶活力只有8%，SDS作用下完全檢測不到酶活力?？梢?，云芝LiP在外界條件下容易受到抑制而降低酶活力。

2.7 云芝LiP的底物濃度效應(yīng)

以該酶不同底物濃度為橫坐標(biāo)，其相對反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)天青B濃度低時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系基本呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)，隨著天青B濃度的增加，反應(yīng)速率不再上升，趨向于1個(gè)極限，說明云芝LiP被天青B所飽和，表現(xiàn)

為零級(jí)反應(yīng)。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，可以求得該云芝LiP的Km為2.05×10-4mol/L(圖8)。

圖7 底物濃度效應(yīng)Fig.7 Effect of substrate concentration on the relative reaction velocity of LiP from C. versicolor

圖8 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求Km值Fig.8 Determination of Km based on Lineweaver-Burk plot

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)云芝LiP的最適溫度為40℃，Aitken等[12]研究的黃孢原毛平革菌LiP的最適溫度為25℃，可見，云芝LiP能夠更好的適應(yīng)較高的溫度環(huán)境。楊金水等[13]研究的斜臥青霉LiP最適溫度為45℃，在55℃時(shí)，其相對熱穩(wěn)定性只有62.5%，同樣有徐淑霞等[14]報(bào)道黃孢原毛平革菌LiP在55℃時(shí)酶活完全被抑制，這些與云芝LiP的溫度穩(wěn)定性基本一致，可見LiP是一個(gè)不耐高溫的酶。LiP的pH值作用范圍一般屬于嚴(yán)格的酸性環(huán)境，如楊金水等[13]研究的斜臥青霉LiP的最適pH值為4.0，Aitken等[12]研究的黃孢原毛平革菌LiP的最適pH值為4.5。云芝LiP的最適pH值在2.5，具有很強(qiáng)的耐酸性。但LiP在此條件下穩(wěn)定性不高，這極大地限制了LiP開發(fā)利用。對于實(shí)驗(yàn)研究的云芝LiP，只有Zn2+表現(xiàn)出了對酶活的促進(jìn)作用，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Cu2+及EDTA、SDS、β-巰基乙醇都表現(xiàn)出抑制作用，這與其他報(bào)道有很大不同[14-15]。由于實(shí)驗(yàn)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中含有藜蘆醇，所以在底物濃度效應(yīng)中選用的底物為天青B。Km為2.05×10-4mol/L，表明云芝LiP對天青B具有較強(qiáng)的特異性，說明天青B可以作為LiP的酶活測定底物。該云芝LiP的產(chǎn)量達(dá)到了7.19×104U/L，具有很好的開發(fā)潛力，但是由于其不穩(wěn)定，以往關(guān)于其性質(zhì)及應(yīng)用的研究并不多，為此，進(jìn)一步提高酶活力、維持酶活性穩(wěn)定的研究可謂具有重要的意義。

實(shí)驗(yàn)初步研究了云芝LiP的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其具有不穩(wěn)定性?？紤]到實(shí)驗(yàn)所用酶液為粗酶液，其中存在較多酶失活因素，建議進(jìn)一步研究時(shí)將酶液純化，以便更好地實(shí)現(xiàn)云芝LiP的開發(fā)利用。

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Enzymological Characteristics of Lignin Peroxidase (LiP) from Coriolus versicolor

JIN Jian，KANG Wen-li，SHENG Ji-ping，CHENG Fan-sheng，WANG Quan-shuai，ZHANG Yan-xin，ZHANG Guo-peng，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In this paper, the enzymological characteristics of lignin peroxidase (LiP) from C. versicolor were investigated. The effects of temperature, pH, metal ions and compounds on the activity and stability of the enzyme were explored. Meanwhile, the relationship between substrate concentration and LiP activity was also studied, and the enzyme was measured for its Km. The highest enzyme activity was 72 U/mL when C. versicolor was cultured for up to 12 days. The optimal temperature and pH of the enzyme were 40 ℃ and 2.5, respectively. It exhibited a good stability in a range from 30 to 40 ℃ for temperature and from 2.0 to 3.5 for pH. Its activity could be activated by Zn2+and inhibited by Ca2+, K+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, EDTA, SDS and β-mercaptoethanol, while Na+had no effect on its activity. The Km of the enzyme was 2.05 × 10-4mol/L.

Coriolus versicolor；lignin peroxidase；temperature；pH；Km

Q554.6

A

1002-6630(2010)17-0224-04

2010-03-31

教育部大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)計(jì)劃建設(shè)項(xiàng)目；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技項(xiàng)目(200803033)

金劍(1987—)，男，本科生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品綜合利用。E-mail：flying364@163.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品綜合利用。E-mail：pingshen@cau.edu.cn