陳 靜，李里特

(1.北京物資學(xué)院物流學(xué)院，北京 101149；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

豆豉水提物對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性影響

陳 靜1，李里特2

(1.北京物資學(xué)院物流學(xué)院，北京 101149；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

本研究收集全國各地的37種豆豉樣品，測試其水提物對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性。結(jié)果表明：37種來源不同的豆豉樣品水提物均對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)一定程度的抑制活性，其中5#(L.Y)、16# (W.N.H)以及21#(M.W)豆豉水提物對α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)較高的抑制活性(P＜0.05)；此外，通過對高活性豆豉的蔗糖和葡萄糖含量檢測，結(jié)果表明，盡管豆豉中含有微量的葡萄糖，但抑制干擾作用甚微。本研究結(jié)果預(yù)示著豆豉中存在可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，這種活性成分呈現(xiàn)較好的水溶性，可能是具有類似糖結(jié)構(gòu)的成分在起作用，有待于深入研究。

豆豉；水提物；α-葡萄糖苷酶抑制；活性成分

現(xiàn)代研究表明，發(fā)酵大豆制品中有著豐富的生物活性物質(zhì)，各種生物活性物質(zhì)各自或相互協(xié)同作用，構(gòu)成了大豆發(fā)酵食品獨(dú)特的生理功能，如抗過敏、抗癌、溶血栓、抗氧化[1]、降血壓[2-3]和抗菌等[4]。但是針對發(fā)酵大豆食品的降血糖活性研究的相關(guān)報(bào)道所見甚少。Fujita等[5]發(fā)現(xiàn)讓邊緣糖尿病人和癥狀較輕的糖尿病人每天服用0.9g豆豉提取物，連續(xù)服用6個(gè)月，平均血糖值由(9.31±0.070)mmol/L降低到(8.61±0.66)mmol/L，且無一例副作用出現(xiàn)；隨后2005年他們后續(xù)研究報(bào)道了豆豉水提物對血脂的影響，讓非糖尿病人和小鼠每頓餐前食入0.3g豆豉提取物，結(jié)果顯示在受試者體內(nèi)三酸甘油酯水平明顯降低，因此也確定了豆豉可長期用來治療糖尿病[6]，但并未對其中降血糖成分進(jìn)行分析、鑒定。我國作為豆豉生產(chǎn)的起源國，有著十分寶貴、分布廣泛的豆豉資源，然而在這方面的研究開展較少。

本實(shí)驗(yàn)中收集了來源于全國各地的37種豆豉樣品，其中南方地區(qū)的樣品分別來源于兩廣及云南地區(qū)；中部地區(qū)的樣品主要采集于湖南、江西及重慶等地；中西部則主要采樣于四川盆地一帶，四川是我國豆豉食用最為廣泛的地區(qū)；北部地區(qū)樣品主要來源東北及陜西一帶。這些豆豉樣品幾乎遍布了中國各地，因此在一定程度上可以代表中國的傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉。從這些豆豉中提取降血糖活性成分，進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價(jià)，深入分析豆豉α-葡萄糖苷酶抑制活性與內(nèi)在成分之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)中所用樣品均購買于全國各地不同地區(qū)的超市、農(nóng)貿(mào)市場，其中一些自制樣品是采樣于當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶家中，豆豉樣品具體品牌、產(chǎn)地及感官狀態(tài)見表1。

4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside)、小鼠腸道丙酮提取粉(intestinal acetone powders of rat) 美國Sigma 公司；蔗糖、葡萄糖測定試劑盒(10 139 041 035) 美國Roche公司；以上均為分析純。

FDU-540真空冷凍干燥機(jī) 日本東京理化公司；Model 550酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司日本東京實(shí)驗(yàn)室；FW 177中草藥粉碎機(jī) 中國天津泰斯特儀器有限公司；TS5BS4高速均質(zhì)機(jī) 德國IKA labortechnik公司；MS-8496F 96微孔板(0.4mL×96) 日本住友電木有限公司；Millx-HV微孔過濾器 日本Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 豆豉樣品水提物的制備

取各種市售豆豉樣品置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，在中草藥粉碎機(jī)中磨成粉末狀，粒度大于6目，然后精確稱取豆豉凍干粉1.000g，置于50.0mL離心管中，加入10.0mL蒸餾水溶解，在均質(zhì)機(jī)中高速均質(zhì)(20000r/min，5min)，然后使用超聲波提取(100W，30min)，取出離心(3700r/min，10min)，取其上清液使用0.45μm 微孔過濾膜過濾，收集過濾液即得豆豉水提物。

1.2.2 豆豉樣品水提物α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)

本研究中所使用的α-葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)方法是本課題組針對豆豉樣品顏色較深的特殊性，參考傳統(tǒng)方法并進(jìn)行部分改進(jìn)[7]，與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相比，此法更適合于一些深顏色樣品的活性檢測。

磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)：稱取NaH2PO4· 2H2O 3.365g，Na2HPO4·12H2O 10.182g，定容到1000mL，調(diào)節(jié)pH6.7，儲存在4℃冰箱。

底物：4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)，質(zhì)量濃度0.9133mg/mL，溶解于磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)中，漩渦混合均勻。

α-葡萄糖苷酶：小鼠丙酮提取物配成質(zhì)量濃度為25mg/mL，溶解于磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)中，漩渦混合均勻，高速離心(9000r/min，15min)，取其上清液待用。

終止液：Na2CO3，71.389mg/mL，溶解在蒸餾水中。

將豆豉水提物在96孔板中加入蒸餾水倍比稀釋，稀釋到2、4、8、16、32、64、128倍，準(zhǔn)備待測。首先在96孔酶標(biāo)板內(nèi)加入120μL的磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH 6.7)，然后加入20μL樣品，在陽性和陰性對照孔里以20μL磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)代替。然后在樣品孔和陽性對照孔里加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液，在樣品對照孔和陰性孔中加入50μL磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH6.7)代替，在微孔板振蕩器上混合均勻。最后在所有的微孔中注入50μL的4-NPG溶液，再次振蕩混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱保溫40～50min。最終

以50μL的Na2CO3溶液的加入終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在405nm波長處測定吸光度。最終以樣品的梯度質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制回歸直線，求其斜率Ki值，Ki值越大，表示樣品抑制活性越強(qiáng)。

表1 豆豉、大醬樣品名稱、產(chǎn)地及感官特性Table 1 Production origins, names and sensory properties of Douchi and miso samples

1.2.3 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖含量的測定

使用蔗糖和D-葡萄糖紫外檢測試劑盒檢測豆豉中的蔗糖和葡萄糖。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，使用S-N-K檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)，在P＜0.05水平數(shù)據(jù)之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆豉水提物對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響

圖1 各種市售豆豉水提物對α- 葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 Anti-α- glucosidase activity of water-extract from vraious commmercial Douchi samples

全國各種市售豆豉樣品水提物的α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。通過對收集到的37種來源不同的豆豉樣品進(jìn)行體外抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示我國大部分豆豉樣品水提物均對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)一定程度的抑制活性。根據(jù)α-葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)方法分析，所得到的抑制斜率值(Ki)越高，表明樣品的抑制活性越強(qiáng)。因此縱觀各種豆豉樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性圖可以看出，我國傳統(tǒng)發(fā)酵所制的豆豉對α-葡萄糖苷酶的確存在著抑制作用。

SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示5#(L.Y)、16#(W.N.H)以及21# (M.W)豆豉樣品的水提物對α-葡萄糖苷酶具有較高的酶抑制活性，其抑制斜率值(Ki)顯著高于其他樣品(P＜0.05)，其他品牌的豆豉樣品呈現(xiàn)一個(gè)相對次低或較低的抑制活性。就豆豉生產(chǎn)的區(qū)域角度分析，3種具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的豆豉來源產(chǎn)地不同，5#(L.Y)豆豉來源于湖南瀏陽地區(qū)，16#(W.N.H)豆豉來源于四川地區(qū)，而21#(M.W)豆豉則源產(chǎn)于江西。豆豉在我國的南方以及中部地區(qū)食用廣泛，且生產(chǎn)廠家較多，并且許多農(nóng)戶自己制作豆豉食用，因此在加工工藝上存在著一定的差異以及不穩(wěn)定性。此外從豆豉樣品中微生物的角度而言，5#(L.Y)豆豉源自湖南地區(qū)，而這一地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉主要以曲霉型為主，16#(W.N.H)豆豉和21#(M.W)豆豉則均為毛霉型豆豉，因此就本實(shí)驗(yàn)篩選到的3種高活性的豆豉樣品而言，其體外抑制活性強(qiáng)弱并不是關(guān)鍵取決于某種或某類微生物的存在與否；另外從感官角度分析，針對豆豉樣品的顏色而言，5#(L.Y)豆豉、16# (W.N.H)豆豉樣品的外觀顏色為黑色，21#(M.W)豆豉樣品的顏色為棕黃色，表明豆豉顏色深淺與其α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)弱無直接關(guān)系。但是不同的豆豉樣品又的確存在著α-葡萄糖苷酶抑制能力的差異，那么差異產(chǎn)生的原因可能在于豆豉樣品生產(chǎn)廠家的加工工藝的區(qū)別，因此發(fā)酵溫度、大豆品種、蒸煮條件、處理工藝以及發(fā)酵時(shí)間等工藝條件的不同都有可能是導(dǎo)致豆豉樣品α-葡萄糖苷酶抑制活性不同的因素。

綜上所述，盡管由于不同豆豉樣品的加工工藝不同而導(dǎo)致了豆豉樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性的強(qiáng)弱不同，但可以明確的是我國傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉樣品的確具有顯著抑制小鼠腸道內(nèi)α-葡萄糖苷酶的作用，預(yù)示著我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉具有潛在的降血糖活性。

2.2 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖的含量

表2 豆豉中蔗糖和葡萄糖的含量Table 2 Contents of sucrose and glucose in Douchi samples g/100g

豆豉水提物中葡萄糖和蔗糖含量檢測如表2所示。由于在α-葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)中，蔗糖和葡萄糖會產(chǎn)生一定的干擾作用，使得所測定的結(jié)果偏高；同時(shí)豆豉作為潛在降糖食品，對明確其中葡萄糖以及蔗糖的含量也是十分必要的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分豆豉樣品中的確含有一定量的葡萄糖和蔗糖，含量維持在1.88%以下。對于篩選得到3種具有高抑制活性的豆豉樣品(5#、16#和21#)，在實(shí)驗(yàn)的檢測范圍內(nèi)并沒有檢測到

蔗糖的存在，但有微量的葡萄糖存在，16#(W.N.H)樣品中含有1.88%的葡萄糖，21#(M.W)豆豉中含有0.153%的葡萄糖，而5#(L.Y)未檢到葡萄糖。與此同時(shí)配制相同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果顯示其抑制活性僅在5%～8%，而豆豉樣品水提物的抑制活性可以達(dá)到60%左右。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明盡管豆豉中有微量的葡萄糖存在，但所起的抑制作用甚微，因此對豆豉樣品抑制活性檢測結(jié)果影響不大，同時(shí)也預(yù)示著豆豉中還存在著其他可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，這種成分呈現(xiàn)較強(qiáng)的水溶性，而且可能具有類似糖結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

37種來源不同的豆豉樣品的水提物均對小鼠腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶均呈現(xiàn)一定程度的抑制活性，其中5# (L.Y)、16#(W.N.H)以及21#(M.W)水提物對α-葡萄糖苷酶具有較高的酶抑制活性(P＜0.05)；通過對高活性豆豉的蔗糖和葡萄糖的檢測，結(jié)果表明盡管豆豉中含有微量的葡萄糖，但抑制干擾作用甚微；通過本實(shí)驗(yàn)的研究預(yù)示著豆豉中存在可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，這種活性成分呈現(xiàn)較好的水溶性，可能是具有類似糖結(jié)構(gòu)的成分在起作用，有待于繼續(xù)深入研究。

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in vitro Inhibitory Effect of Water Extract from Douchi on Alpha-glucosidase Activity

CHEN Jing1，LI Li-te2
(1. Logistics School, Beijing Wuzi University, Beijing 101149, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Thirty-seven Douchi samples collected from various regions of China were tested for the inhibitory effects of their water extracts on alpha-glucosidase in vitro. The water extracts from all these Douchi samples could inhibit mouse intestinal alpha-glucosidase to a certainty extent. In addition, samples NO.5 (L.Y), NO.16 (W.N.H) and NO.21 (M.W) showed stronger inhibitory effect against the enzyme (P ＜ 0.05). Moreover, microamounts of glucose existing in Douchi samples had less interrupting effect on the anti-hyperglycemic activity of Douchi water extract. This study suggests that there are some active components in Douchi, which can strongly inhibit alpha-glucosidase and present excellent water solubility. These components may have sacchride-like structures. However, this needs to be deeply investigated.

Douchi；water extract；alpha-glucosidase；active components

TS214.9

A

1002-6630(2010)17-0064-04

2010-01-07

陳靜(1978—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)及生物技術(shù)。E-mail：chenjingsusan@126.com