蔡恩博，趙 巖，楊智慧，田 陽，陳紅梅，高 瑜，吳 謙，鄭友蘭*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

豬牙花乙醇提取物抑菌活性、抗氧化作用及豬牙花中微量元素的測(cè)定

蔡恩博，趙 巖，楊智慧，田 陽，陳紅梅，高 瑜，吳 謙，鄭友蘭*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

目的：對(duì)豬牙花乙醇提取物的抑菌活性、抗氧化作用進(jìn)行研究，并測(cè)定豬牙花中微量元素的含量。方法：以豬牙花全草80%乙醇提取物為材料，采用濾紙片法對(duì)4種常見細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制活性、最低抑菌濃度進(jìn)行測(cè)定，并討論溫度、pH值及紫外線對(duì)提取物抑菌效果的影響；采用羥自由基法測(cè)定其抗氧化作用；采用原子吸收分光光度法測(cè)定其微量元素鐵、錳、鋅、銅的含量，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：豬牙花全草80%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為12.5mg/mL，對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度均為100mg/mL，對(duì)大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為200mg/mL。熱處理、酸性環(huán)境、紫外照射等對(duì)抑菌作用均無明顯影響。豬牙花提取液在0.0025～0.32mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除率達(dá)到64.57%。其提取物IC50值為0.051mg/mL。微量元素Fe含量為633.25μg/g；Mn為30.45μg/g；Zn為39.95μg/g；Cu為12μg/g。結(jié)論：豬牙花80%乙醇提取物有著良好的抑菌效果及較強(qiáng)的抗氧化作用，且豬牙花中微量元素含量較高，具有很大的開發(fā)價(jià)值。

豬牙花；抑菌；抗氧化；微量元素

豬牙花(Erythronium japonicum Decne.)為百合科(Liliaceae)豬牙花屬(Erythronium)多年生草本植物。生于林下濕地。分布于我國(guó)東北地區(qū)；朝鮮，日本也有分布[1]?，F(xiàn)代研究表明，微量元素與人體的生物功能也有著密切關(guān)系[2]，微量元素在人體內(nèi)含量雖然很少，但卻是人體不可或缺的元素。

人體在生命活動(dòng)的氧化代謝過程中會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基，體內(nèi)過多自由基對(duì)生物大分子造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能減退，并對(duì)機(jī)體的衰老過程產(chǎn)生影響[3]，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。而人工合成的抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用[4]。所以評(píng)價(jià)和篩選具有強(qiáng)抗氧化活性的天然植物己成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢(shì)。

目前，豬牙花這種植物國(guó)內(nèi)外均無研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬牙花乙醇提取物的抑菌活性及其抗氧化作用進(jìn)行研究，并對(duì)微量元素含量進(jìn)行測(cè)定，以期為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬牙花(Erythronium japonicum Decne.)采集于吉林省臨江市老嶺基地。樣品經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院胡全德教授鑒定為豬牙花。

甲基紫、Tris緩沖溶液、H2O2溶液、FeSO4溶液、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硝酸(優(yōu)級(jí)純)、高氯酸(優(yōu)級(jí)純)等，其他試劑均為分析純，測(cè)定與分析用水均為超純水。

1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella enterica)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 儀器與設(shè)備

3510/3511型原子吸收分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV2300紫外分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；VELP凱氏定氮儀消化爐 Mitamura Riken Kogyo公司；百靈LA114型電子天平(110g/0.0001g) 常熟市百靈天平儀器有限公司；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 豬牙花乙醇提取液的制備

稱取干燥豬牙花全草80g，粉碎，用10倍量80%乙醇浸泡12h，之后超聲提取，超聲時(shí)間30min，溫度30℃，過濾，之后分別用8倍量、6倍量80%乙醇重復(fù)提取兩次。合并濾液，減壓濃縮成至100mL，60℃將部分溶液 蒸干成浸膏，另一部分溶液保存于0～4℃冰箱，備用。

1.4.2 豬牙花提取液抑菌實(shí)驗(yàn)

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備[5]：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸餾水1000mL、瓊脂20.0g、pH7.0。

濾紙片法測(cè)定最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)[6-7]：將1.4.1節(jié)中的提取液用二倍稀釋法進(jìn)行稀釋，質(zhì)量濃度分別為800、400、200、100、50、12.5mg/mL。培養(yǎng)皿上分別接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各0.2mL(菌濃度106CFU/mL)，涂布均勻，然后將直徑5mm的滅菌濾紙片在提取液中浸泡2h后貼在培養(yǎng)基上，每皿3片等距放置，每菌3份平行，另外，每個(gè)菌種用滅菌的濾紙片做一份空白對(duì)照及鏈霉素(100μg/mL)進(jìn)行陽性對(duì)照，置培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)24h。用十字交叉法測(cè)量并記錄抑菌圈的大小，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，得不同質(zhì)量濃度提取物對(duì)供試菌的抑菌效果，抑菌圈不明顯所對(duì)應(yīng)的提取物濃度即為最低抑菌濃度。

抑菌活性對(duì)熱穩(wěn)定性測(cè)定[8]：用試管分裝2mL 400mg/mL的提取液，分別置于40、60、80、100℃水浴處理30min，然后降至室溫。以金黃色葡萄球菌為指示菌采用濾紙片法測(cè)定其抑菌效果。

抑菌活性對(duì)紫外光穩(wěn)定性測(cè)定：將2mL 400mg/mL提取液分裝于9cm培養(yǎng)皿中，置紫外燈365nm波長(zhǎng)下分別照射5、15、30、45、60min，以金黃色葡萄球菌為指示菌采用濾紙片法測(cè)定其抑菌效果。

抑菌活性對(duì)酸堿穩(wěn)定性測(cè)定：用0.1mol/L稀鹽酸和稀氨水溶液將400mg/mL豬牙花提取液的pH值分別調(diào)至2、4、6、8、10，以金黃色葡萄球菌為指示菌采用濾紙片法測(cè)定其抑菌效果。

1.4.3 豬牙花提取物抗氧化實(shí)驗(yàn)

樣品溶液的制備：精密稱取1.4.1節(jié)中豬牙花浸膏0.25g置于50mL具塞容量瓶中，加入適量的蒸餾水，密封超聲30min，待其溶解完全后，定容至刻度，得到樣品母溶液，備用。在樣品母溶液中，用移液槍精密移取體積為5、10、20、40、80、160、320、640μL的樣品母液，用蒸餾水定容于10mL容量瓶中得到質(zhì)量濃度為0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/mL的樣品溶液。

試劑的制備：稱取0.2032g甲基紫用去離子水定容于100mL容量瓶中，備用。用鹽酸調(diào)Tris緩沖溶液pH值為3.5，備用。取體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶液1.0mL，用去離子水定容于100mL容量瓶中，備用。稱取0.0695g FeSO4·7H2O 用水定容于50mL容量瓶中，備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

羥自由基(·OH)的產(chǎn)生及測(cè)定：取配制好的甲基紫溶液2mL，Tris緩沖液1mL，按順序放入10mL的刻度管中。并用去離子水定容至刻度，搖勻靜置30min，測(cè)定吸光度A578nm。取配制好的甲基紫溶液2mL，Tris緩沖液1mL，F(xiàn)e2+溶液1mL，H2O2溶液1mL按順序放入10mL的刻度管中。并用去離子水定容至刻度，搖勻靜置30min，測(cè)定吸光度記為A0。取配制好的甲基紫溶

液2mL，Tris緩沖液1mL，不同濃度梯度的待測(cè)液2mL，F(xiàn)e2+溶液1mL，H2O2溶液1mL按順序放入10mL的刻度管中。并用去離子水定容至刻度，搖勻靜置30min。平行3次，測(cè)定吸光度記為As。

利用SPSS 16.0軟件分析，得出50%抑制濃度(IC50值)。

1.4.4 微量元素的含量測(cè)定

樣品處理：精密稱取豬牙花樣品2.0000g于凱氏瓶?jī)?nèi)，3份平行，取20mL事先配好的HNO3-HClO4溶液分別加到瓶?jī)?nèi)，密封過夜。加熱消化，至溶液呈白色近干為止。冷卻后，定容至50mL，混勻備用。同法制備空白溶液。測(cè)定儀器為原子吸收分光光度計(jì)，附80586微機(jī)和FAAS軟件，工作條件見表1。

表1 原子吸收分光光度計(jì)工作條件表Table 1 Working conditions of atomic absorption spectrophotometer

微量元素校準(zhǔn)曲線：4種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，均由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋而得，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，以配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，計(jì)算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。各元素回收率在99.60%～102.53%之間，能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

表2 微量元素回歸方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and their correlation coefficients for trace element determination

2 結(jié)果與分析

2.1 豬牙花提取液抑菌實(shí)驗(yàn)

2.1.1 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測(cè)定

由表3可知，豬牙花提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為12.5mg/mL，對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度均為100mg/mL，對(duì)大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為200mg/mL。

表3 豬牙花提取液對(duì)4種細(xì)菌的抑菌作用Table 3 Antibacterial activities of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne against four common bacteria

2.1.2 熱處理對(duì)豬牙花提取液抑菌活性的影響

圖1 熱處理對(duì)豬牙花提取液抑菌活性的影響Fig.1 Effect of thermal treatment on the anti-Staphylococcus aureus of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

由圖1可知，豬牙花提取物具有良好的熱穩(wěn)定性，即使經(jīng)高溫100℃處理后，仍具有較高的抑菌活性。

2.1.3 紫外光對(duì)豬牙花提取液抑菌活性的影響

圖2 紫外光對(duì)豬牙花提取液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of ultraviolet irradiation on the anti-Staphylococcus aureus of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

由圖2可知，豬牙花提取物在紫外光照射的條件下，抑菌活性基本穩(wěn)定，在紫外光照射60min時(shí)仍有較強(qiáng)的抑制效果。

2.1.4 不同pH值對(duì)豬牙花提取液抑菌活性的影響

圖3 pH值對(duì)豬牙花提取物抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH on the anti-Staphylococcus aureus of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

由圖3可知，豬牙花提取物條件穩(wěn)定，pH10時(shí)其抑菌效果最好。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豬牙花對(duì)金黃色葡萄球菌等4種常見致病菌及食品腐敗菌具有良好的抑菌效果，4種供試菌的抑制效果依次為：金黃色葡萄球菌＞沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌。豬牙花提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，最小抑菌質(zhì)量濃度為12.5mg/mL。豬牙花提取物經(jīng)高溫100℃處理后，仍具有較高的抑菌活性，說明其具有良好的耐熱性。經(jīng)紫外光照射60min、pH4～10仍具有穩(wěn)定的抑菌活性，可見其對(duì)高溫、紫外照射和酸性條件下都有良好的穩(wěn)定性，可將提取液加入到食品中，提高加工食品的保存性。

2.2 豬牙花提取液的抗氧化實(shí)驗(yàn)

表4 不同質(zhì)量濃度豬牙花提取物清除羥自由基結(jié)果Table 4 Hydroxyl free radical scavenging effects of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne at different concentrations

由表4可知，隨著豬牙花提取液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥自由基清除呈明顯的量效關(guān)系，豬牙花提取液在0.0025～0.32mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除率達(dá)到64.57%。

由此得出豬牙花根提取物(IC50)為0.051mg/mL。這說明豬牙花乙醇提取物對(duì)羥自由基有很強(qiáng)的清除作用。為開發(fā)天然抗氧化藥品、治療因人體內(nèi)自由基過多而產(chǎn)生的疾病提供了有力的依據(jù)。

2.3 豬牙花提取物微量元素含量

由表5可知，豬牙花的微量元素含量很高，其中Fe的含量為最高，已達(dá)633.25μg/g，其他含量高低順序依次為Zn＞Mn＞Cu。

表5 豬牙花提取物微量元素含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of determination of trace elements in the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

3 討論與結(jié)論

有資料顯示魚腥草中抑菌的有效成分為魚腥草素，具有抗菌、抗病毒、利尿、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，可用于呼吸道感染等疾病，其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為31.3mg/mL[8]，對(duì)比可知，豬牙花對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果更強(qiáng)，可見其在針對(duì)于金黃色葡萄球菌的抗菌劑市場(chǎng)具有廣闊的開發(fā)前景。

由于微量元素與人體健康及壽命有關(guān)，這4種元素對(duì)人體有直接的影響，參與許多新陳代謝的過程，鋅銅比值與心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的發(fā)病機(jī)率呈正相關(guān)性[9-11]。正常人的比值在10.5～16.5之間，患者體內(nèi)的比值在12.5～18.5之間[9]，豬牙花中鋅銅比值為3.33，可降低患者體內(nèi)的比值。

豬牙花提取物IC50值為0.051mg/mL，表明該提取物有很強(qiáng)的抗氧化作用，這可能于該植物中含有某種化學(xué)成分有關(guān)，有待深一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬牙花的微量元素含量測(cè)定，抑菌活性及抗氧化作用的研究表明，豬牙花乙醇提取物有很強(qiáng)的抑菌效果，清除羥自由基能力較強(qiáng)，而且豬牙花微量元素的含量很高。另一方面，豬牙花這種物質(zhì)資源豐富、分布廣泛，有很大的發(fā)展?jié)摿?，這對(duì)于研究豬牙花提取物在食品及醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用具有重要的意義，有望開發(fā)成為天然防腐劑及藥物。

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Antibacterial and Hydroxyl Radical Scavenging Activities and Trace Element Determination of Ethanol Extract from Erythronium japonicum Decne

CAI En-bo，ZHAO Yan，YANG Zhi-hui，TIAN Yang，CHEN Hong-mei，GAO Yu，WU Qian，ZHENG You-lan*
(College of Chinese Medicinal Material, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To evaluate whether the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne has antibacterial activity and the ability to scavenge hydroxyl radicals and determine its trace elements. Methods: The antibacterial activity of the ethanol extract against four common bacteria was assessed by measuring its minimal inhibitory concentrations (MIC) by filter paper method and the effects of temperature, pH and UV irradiation on its antibacterial activity were dealt with. Trace elements such as iron, magnesium, zinc and copper were determined using atomic absorption spectrophotometry. Experimental results were subjected to statistical analysis using SPSS16.0. Results: The MICs of the ethanol extract were 12.5, 100, 100 mg/mL and 200 mg/mL for Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus subtilis and Escherichia coli, respectively. Thermal treatment, acidic environment and UV irradiation had no obvious effect on the antibacterial activity of the ethanol extract. The contents of iron, magnesium, zinc and copper of the ethanol extract were 633.25, 30.45, 39.95μg/g and 12μg/g, respectively. Conclusion: Erythronium japonicum Decne contains high levels of trace elements and exhibits excellent antibacterial and hydroxyl radical scavenging activities. Thus, this herb has a high exploitation value.

Erythronium japonicum Decne；antibacterial activity；hydroxyl radical scavenging activity；trace elements

R931.71

A

1002-6630(2010)17-0060-04

2010-01-06

蔡恩博(1982—)，男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究。E-mail：caienbo8251@163.com

*通信作者：鄭友蘭(1956—)，女，教授，主要從事新藥研究與開發(fā)。E-mail：zcx_11@126.com