于豐宇，李 林，王 紅，王文斟，何 源，劉曉朋，凌 華

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042)

應(yīng)用PCR 技術(shù)快速測定食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力

于豐宇1，李 林1，王 紅2，王文斟2，何 源2，劉曉朋2，凌 華2

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042)

目的：采用PCR技術(shù)準(zhǔn)確、快速測定單核細(xì)胞增生李斯特菌(單增李斯特氏菌)分離株的毒力基因，鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株或無毒株，以有效地限制李斯特氏菌病的傳播。方法：以單增李斯特氏菌相關(guān)毒力基因(hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA)設(shè)計引物，檢測重慶市2007—2009年分離的40株單增李斯特氏菌分離株中的毒力基因攜帶率，并進(jìn)行小鼠毒力實驗。結(jié)果：40株分離株中有15株7種毒力基因檢測結(jié)果均為陽性，6株hly基因陰性，4株plcB基因陰性，4株prfA基因陰性，5株inlA、inlB基因陰性，11株inlC基因陰性，9株inlJ基因陰性，1株inlA、inlB、inlC、inlJ基因均為陰性。4株分離株的毒力與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC191161E相當(dāng)，小鼠LD50在1.2×108～6.0×108CFU/mL之間，為強(qiáng)毒株。篩選出弱毒株09-132，LD50為1.7×1011CFU/mL。結(jié)論：重慶市存在發(fā)生李斯特菌食物中毒的潛在危險，內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是導(dǎo)致菌株毒力降低的原因，而prfA和plcB基因與菌株毒力的相關(guān)性較小。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；毒力；基因；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特氏菌)屬于李斯特氏菌屬(Listeria)，是一種人畜共患的病原菌，可穿越宿主三道屏障，引起人和動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，發(fā)病率不高，死亡率可達(dá)20%～30%[1]。自1926年首次分離出單增李斯特氏菌后，李斯特氏菌病現(xiàn)已呈世界性分布。近年來隨著人們生活節(jié)奏的加快，我國冷藏、速凍食品消費量迅速增多，食品中單增李斯特氏菌的潛在危險性也越來越大。目前，美國、歐盟等一些國家對食品中單增李斯特氏菌的污染非常重視，我國近年也將食品中單增李斯特氏菌的污染檢測作為一項必檢的安全指標(biāo)。由于不同來源的單增李斯特氏菌毒力差異較大，

有些菌株致病性很強(qiáng)，而有些菌株毒力較弱甚至無致病性[2]，因此準(zhǔn)確、快速測定單增李斯特氏菌分離株的毒力具有重大意義，其可有效地限制李斯特氏菌病的傳播以及減少不必要的食品召回。

單增李斯特氏菌致病力的測定包括小鼠毒力實驗、體外培養(yǎng)細(xì)胞實驗和毒力相關(guān)蛋白及基因的檢測。小鼠毒力實驗為體內(nèi)檢測細(xì)菌致病力的方法，是其他毒力檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)，但實驗成本高、且耗時，體外培養(yǎng)細(xì)胞實驗相對于小鼠毒力實驗成本較低，且操作簡便，雖然具有重要的細(xì)菌毒力預(yù)測價值但相對費時。隨著單增李斯特氏菌及無害李斯特氏菌全基因組序列的測定，己鑒定出若干新的毒力相關(guān)基因，使通過基因檢測測定單增李斯特氏菌的致病力成為可能。Liu等[3]借助比較基因組學(xué)方法分析強(qiáng)毒株中特有的毒力基因lmo2821、lmo0733，建立了相應(yīng)的PCR方法以鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株(或無毒株)。

本實驗采用PCR技術(shù)，對重慶市2007—2009年分離到的40株單增李斯特氏菌食品分離株進(jìn)行毒力基因檢測，分析不同食品樣品中菌株的毒力基因攜帶情況，并結(jié)合小鼠毒力實驗，鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株或無毒株，擬建立相應(yīng)的評估指標(biāo)，為該病原菌的監(jiān)控、預(yù)警及爆發(fā)食物中毒后追蹤感染源及傳播途徑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 54004和 ATCC 191161E 由重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗所提供。40株單增李斯特氏菌自重慶市各大農(nóng)貿(mào)市場的生鮮食品中分離所得，均經(jīng)GB/T4789.30—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》標(biāo)準(zhǔn)方法檢測確認(rèn)。

Taq DNA 聚合酶、dNTP 寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖 TaKaRa 公司；API Listeria 生化鑒定試劑條 法國生物梅里埃公司；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基 鄭州博賽公司。

1.1.2 實驗動物

ICR小鼠(雌性，體質(zhì)量20～22g)由重慶市中藥研究院實驗動物中心提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PTC-200 核酸擴(kuò)增儀 美國MJ 公司；TGL-16高速臺式離心機(jī) 南京艾賽特科技發(fā)展有限公司；DYY-11型電泳儀 杭州匯爾儀器有限公司；Chemi DocXRS凝膠成像儀 美國伯樂公司；微量移液器 法國吉爾森公司。

1.2 PCR 方法

1.2.1 引物合成

針對單增李斯特氏菌的hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA基因選取7 對特異性引物[4-8]，委托生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列見表1。

表1 單增李斯特氏菌相關(guān)毒力基因的引物Table 1 Primers used in the PCR assay forL. monocytogenesgenes

1.2.2 模板DNA 制備

將待檢菌株劃線接種腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落溶于1mL無菌純水的離心管中制成濃菌懸液，100℃煮沸10min，12000r/min離心5min，取上清保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)

反應(yīng)體系：模板DNA 2μL、10μmol/L上下游引物各1μL、各25mmol/L dNTP 1μL、5U/μL Taq 酶0.2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、10×buffer 2.5μL、純水15.8μL，總體積25μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10min；再按94℃變性1min，退火20s (退火溫度按表1)，72℃延伸20s，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸8min。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及100bp DNA Ladder Marker分別上樣5μL，電泳。膠塊在溴化乙錠中浸泡20min，觀察電泳結(jié)果，并對其進(jìn)行分析。

1.3 小鼠LD50實驗

將待檢菌株過夜培養(yǎng)物8000r/min離心5min以收集菌體。沉淀用PBS反復(fù)離心漂洗3次，用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，以麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，調(diào)節(jié)菌濃度至約1×108CFU/mL，并進(jìn)行一系列的10倍梯度稀釋，平板計數(shù)以確定實際接種量。同時選取不同的稀釋度腹腔接種于ICR雌性小鼠，劑量為0.2mL，每組接種6只

小鼠，共4組，并分別于接種后每隔12h進(jìn)行一次觀察，連續(xù)觀察7d，以Karber法[9]計算LD50。

1.4 血清學(xué)實驗

血清分型是一種傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H 抗原，可將單增李斯特氏菌分為16 個血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b 和7。參照單增李斯特氏菌診斷血清使用說明書，O抗原采用玻片凝集法，H抗原采用試管凝集法。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

表2 單增李斯特氏菌毒力基因PCR檢測結(jié)果Table 2 PCR results of virulence-associated genes ofListeria monocytogenes

單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)株及40株單增李斯特氏菌分離株毒力基因PCR 檢測結(jié)果見表2。

由表2可知，40株單增李斯特氏菌分離株中有15株7種毒力基因檢測結(jié)果均為陽性，6株hly基因陰性，4株plcB基因陰性，4株prfA基因陰性，5株inlA、inlB基因陰性，11株inlC基因陰性，9株inlJ基因陰性，其中有1株inlA、inlB、inlC、inlJ基因均為陰性。結(jié)合菌株來源分析，可知生禽肉中單增李斯特氏菌內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)陽性率高于生畜肉。各基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1～7。

圖1 hly的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofhly

圖2 plcB的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofplcB

圖3 inlA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlA

圖4 prfA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofprfA

圖5 inlB的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlB

圖6 inlC的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlC

圖7 inlJ的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlJ

2.2 小鼠毒力實驗結(jié)果

從40株單增李斯特氏菌分離株中選取21株毒力基因攜帶具有差異性的菌株進(jìn)行小鼠毒力實驗，結(jié)果見表3。

表3 小鼠毒力實驗結(jié)果Table 3 Results of toxicity test in mice

如表3所示，番茄分離株09-132毒力最弱(LD50為1.7×1011CFU/mL)。有4株單增李斯特氏菌分離株(08-32、09-137、09-116、09-465)的毒力與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC191161E相當(dāng)，LD50在1.2×108～6.0×108CFU/mL之間。其他分離株的毒力弱于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC191161E，LD50介于2.1×109～7.3×1010CFU/mL之間。

2.3 單增李斯特氏菌毒力基因與毒力的相關(guān)性分析

食品分離株的毒力強(qiáng)弱與血清型無關(guān)。一般研究認(rèn)為，食源性李斯特氏菌病發(fā)生多由血清4b型引起，其次是1/2a、1/2b[10]，但本實驗發(fā)現(xiàn)少數(shù)4d、4c血清型菌株的毒力強(qiáng)于4b、1/2a及1/2b血清型的菌株，它們同樣具有引起食源性李斯特氏菌病發(fā)生的可能性。通過血清分型來排除弱毒株的方法是不可行的。

從速凍食品中分離出的單增李斯特氏菌，發(fā)現(xiàn)有特異型缺乏hly、prfA的菌株，但這些菌株的毒力與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的毒力相比沒有明顯降低，可能是變異產(chǎn)生了其他未知的毒力因子，有待于進(jìn)一步研究。 有一株生肉中分離出的單增李斯特氏菌(07-140)，缺失hly、plcB、inlC、inlJ、prfA基因，小鼠LD50為 6.0×109CFU/mL，其毒力較強(qiáng)毒株ATCC191161E(2.5×108CFU/mL)略低，可見inlA、inlB所產(chǎn)生的毒力因子對菌株致病力的貢獻(xiàn)較大。

缺失plcB基因的菌株毒力(6.0×108CFU/mL)較其他毒力基因攜帶完整的菌株略低，但不存在顯著的相關(guān)性。

內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)缺失的菌株與攜帶完整毒力基因的菌株相比相對毒力差異較大，內(nèi)化素基因的缺失可能是導(dǎo)致菌株毒力降低的原因，缺失不同內(nèi)化素基因的菌株毒力差異見表4。

表4 缺失不同內(nèi)化素基因的菌株毒力Table 4 Mouse virulence ofListeria monocytogenesstrains losing different internalized genes

由表4可知，內(nèi)化素基因inlA、inlB、inlJ、inlC與菌株毒力存在顯著相關(guān)性，inlC對菌株毒力的影響較大，可作為區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株的標(biāo)志基因。但不同內(nèi)化素基因與毒力的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。

3 討 論

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為一嗜冷菌，能在食品低溫冷藏過程中生長繁殖。美國每年大約有2500人因感染單增李斯特氏菌繼發(fā)嚴(yán)重的疾病，大約有500人死亡[11]。我國食品污染物監(jiān)測網(wǎng)從2000 年起開展對食品中單增李斯特氏菌的監(jiān)測，隨著對該菌的重視和檢測技術(shù)的提高，食品中單增李斯特氏菌的檢出率明顯提高。

實驗中有2株分離株API Listeria生化試劑條結(jié)果為單增李斯特氏菌，但7種毒力基因均未被檢測到，因此認(rèn)為此兩株菌可能是單增李斯特氏菌，未將其計入實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)?？梢妭鹘y(tǒng)的生化檢驗并不完全準(zhǔn)確，單增李斯特氏菌的毒力基因檢測可以是傳統(tǒng)鑒定方法的一個補(bǔ)充，建立PCR方法檢測毒力基因?qū)焖僭\斷食物中毒具有現(xiàn)實意義。

目前有關(guān)報道表明所有致病性的單增李斯特氏菌都含有inlA、inlB[12-13]，本實驗結(jié)果顯示同時含有inlA、inlB內(nèi)化素基因的菌株約占89.7%，可見該地區(qū)存在著該菌引起李斯特氏菌病的潛在危險，尤其是速凍食品、肉制品和水產(chǎn)品中同時含有inlA、inlB的菌株所占比例較大，番茄中的單增李斯特氏菌不含有inlA、inlB，自然界中可能存在已發(fā)生變異的非典型的單增李斯特氏菌，缺失或改變了這些基因，這些變異對它的生存、繁殖、致病性等方面到底有何影響需要進(jìn)一步研究。

隨著inlA、inlB、inlC、inlJ天然缺失株的出現(xiàn)，可以推測單增李斯特氏菌某些對致病力起決定作用的毒力基因正在消失。病原菌這種向著毒力減弱或消失方向進(jìn)化的例子比較罕見。但從理論上講，像單增李斯特氏菌這樣亦可在自然界(如水、土壤、植物等) 自由生活的細(xì)菌，與致病力相關(guān)的基因?qū)ζ洳⒎潜匦?，將其缺失并不影響?xì)菌的生存與增殖[14]，因此這樣的基因片段可以看作一種不必要的負(fù)荷，即“基因垃圾”；在自然選擇的壓力下，這種垃圾基因可能會被清除，以使細(xì)菌能更好地適應(yīng)生存環(huán)境。

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Rapid PCR Detection of Listeria monocytogenes Virulence in Food

YU Feng-yu1，LI Lin1，WANG Hong2，WANG Wen-zhen2，HE Yuan2，LIU Xiao-peng2， LING Hua2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Center for Disease Control and Prevention, Chongqing 400042, China)

Objective: The virulence-associated genes of Listeria monocytogenes (L.m) isolates were detected by PCR amplification assay in order to provide experimental

for evaluating the virulence of L.m isolates and effectively limiting the transmission of L.m. Methods: Forty strains of L.m isolated in Chongqing from 2007 to 2009 were subjected to the PCR detection of seven virulence-associated genes (hly, plcB, inlA, inlB, inlC, inlJ, prfA) and toxicity test in mice. Results: The PCR assay revealed that 15 of the 40 L.m isolates possessed all the seven virulence-associated genes, 6 strains were hly-, 4 strains were plcB-, 4 strains were prfA-, 5 strains were inlA-, inlB-, 11 strains were inlC-, 9 strains were inlJ-, and 1 strain was negative for inlA, inlB, inlC and inlJ. Four isolates were defined as virulent strains, whose virulence was equivalent to the standard strain, ATCC 1961E with a mouse LD50 between 1.2 × 108CFU/mL and 6.0 × 108CFU/mL. The LD50 of the screened low virulent strain 09-132 was 1.7 × 1011CFU/mL . Conclusions: There is a potential risk of Listeria food poisoning in Chongqing City, and the internalized gene (inlA, inlB, inlC, inlJ) loss may lead to virulence declination, while the prfA and plcB genes are less relevant to the virulent isolates.

Listeria monocytogenes；virulence；gene；PCR

TS 207.7

A

1002-6630(2010)23-0164-05

2010-08-02

于豐宇(1985— )，女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：1985yufengyu@163.com