呂 添，曹正茂，武海濤，王小紅*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌p60蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

呂 添，曹正茂，武海濤，王小紅*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p60和獲得重組宿主菌E.coli BL21(DE3)的基礎(chǔ)上，對重組宿主菌E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)p60蛋白條件的優(yōu)化研究。結(jié)果表明：將重組大腸桿菌培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.7～0.8左右時，加入濃度為1mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在搖床溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)6h，可得到重組表達(dá)的p60蛋白占總蛋白的比例為42.32%，其中可溶性蛋白占總p60蛋白的比例為85.36%左右，為p60蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件。

單核細(xì)胞增多性李斯特菌；p60蛋白；表達(dá)條件；優(yōu)化

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是李斯特菌屬(Listeria)中最重要的人類食源性病原菌[1]，呈世界性分布。該菌具有低溫生長的特性，在冷藏食品中容易達(dá)到感染致病所需的菌量，是冷藏食品和即食食品污染的重要致病菌之一[2]。LM可導(dǎo)致人和動物的敗血癥、腦膜炎及流產(chǎn)等，病死率高達(dá)30%～70%[3-4]。因此，建立快速而有效的LM檢測方法是目前針對冷藏食品安全的研究熱點之一。LM是典型的胞內(nèi)寄生菌，由其主要毒力因子iap基因編碼的p60蛋白，是LM的保護性免疫中一個重要的抗原成分，也能刺激機體B細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并與該菌的侵襲性密切相關(guān)[5-6]。p60蛋白分子質(zhì)量為60kD，由478個氨基酸殘基所組成，含有一個Thr-Asn的重復(fù)序列區(qū)域，具有水解酶和酰胺酶活性，其N端和C端區(qū)域都具有高度的保守性，是目前研究LM新型疫苗及建立快速檢測方法的首選對象[7]。為此，國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)單增李斯特菌iap基因的序列，利用分子生物學(xué)的方法對其表達(dá)的p60蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)方面的研究[8-9]，但對表達(dá)菌株培養(yǎng)表達(dá)p60蛋白的條件研究比較少。

本研究在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p60并轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21(DE3)的基礎(chǔ)上[10]，進(jìn)一步研究與重組菌的高效表達(dá)相關(guān)的幾個重要培養(yǎng)條件，如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機、生長環(huán)境的溫度、誘導(dǎo)時間以及誘導(dǎo)過程中氧氣含量等對p60蛋白表達(dá)的影響。旨在用最經(jīng)濟的方法大量制備p60蛋白，并在提高表達(dá)量的前提下，盡量讓目的蛋白以可溶性形式表達(dá)，減少無活性

的不可溶的包涵體的產(chǎn)生，同時也免去變性與復(fù)性的純化過程，使蛋白純化更簡便、更經(jīng)濟，為進(jìn)一步研究p60蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和建立李斯特菌快速免疫檢測方法提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

重組表達(dá)載體pET-28a-iap和重組宿主菌E.coli BL21 (DE3)由本實驗室構(gòu)建并保存[10]。

1.1.2 試劑

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG) Sigma公司，卡那霉素(Kanamycin) 昆明杰渾生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker Fermentas公司；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器與儀器

VD-1320超凈工作臺 哈爾濱東聯(lián)電子有限公司；722N可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；超聲波破碎儀 美國Sonics and Materials公司；迷你型垂直板電泳型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 重組菌的培養(yǎng)

無菌操作條件下，將重組菌E.coli BL21(DE3)接種于5mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)物按體積比1:100接種于50mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右，加入一定量的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.2 誘導(dǎo)時機對蛋白表達(dá)量的影響

分別在重組菌培養(yǎng)至OD600nm值為0.16、0.33、0.54、0.77、1.09、1.36時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)5h后，取培養(yǎng)液于離心管中，5000r/min 離心5min收集菌體。沉淀用0.02mol/L pH7.4 PBS緩沖液重懸，按體積比4:1加入5×上樣緩沖液，于沸水中煮5min后將樣品進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳(濃縮膠5%、分離膠12%)。電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液于搖床上振蕩30min進(jìn)行染色，然后用0.5mol/L NaCl脫色液進(jìn)行多次脫色至背景色被脫去[11]。脫色后的凝膠于凝膠成像系統(tǒng)下拍照，使用Bandscan[12]和Quantity one[13]軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 誘導(dǎo)劑濃度對蛋白表達(dá)量的影響

在重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時，將培養(yǎng)液在超凈工作臺中分裝于無菌三角瓶中，加入終濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1、2、5mmol/L的IPTG，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)5h后，按照1.2.2節(jié)的方法收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)量的影響

將重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時，將培養(yǎng)液在超凈工作臺中分裝于無菌三角瓶中，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，分別于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7 h后取出，按照1.2.2節(jié)的方法收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)量及可溶性的影響

將重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時，將培養(yǎng)液在超凈工作臺中分裝于無菌三角瓶中，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，分別于37、30、25℃下200r/min振蕩培養(yǎng)5h，離心收集菌體，加入10mL 0.02mol/L pH7.4 PBS緩沖液重懸，置于冰浴中用超聲探頭進(jìn)行超聲波間歇破碎15min(超聲5s，間隔5s)，8000r/min離心30min分離上清和沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至另一容器，沉淀用10mL 0.02mol/L pH7.4 PBS緩沖液進(jìn)行重懸，各取20μL加入5μL 5×上樣緩沖液后進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對蛋白表達(dá)量及可溶性的影響

將重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時，將培養(yǎng)液在超凈工作臺中分裝于無菌三角瓶中，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，在30℃下分別于100、150、200r/min振蕩培養(yǎng)5h，離心收集菌體，按1.2.5節(jié)中的操作對菌體進(jìn)行超聲處理和SDS-PAGE電泳分析。

1.2.7 最佳誘導(dǎo)條件下p60蛋白的表達(dá)分析

根據(jù)上述實驗結(jié)果確定最佳誘導(dǎo)條件，并在此條件下進(jìn)行p60蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，分析p60蛋白的表達(dá)量和可溶性。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)時機對蛋白表達(dá)量的影響

圖1 誘導(dǎo)時機對p60蛋白表達(dá)量的影響SDS-PAGE分析Fig.1 Effect of time of IPTG addition on expression of p60 protein examined by SDS-PAGE

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖1所示，當(dāng)OD600nm值小于0.77

時，p60蛋白表達(dá)量隨OD600nm值增大而增加，可達(dá)到最大值38.3%，而OD600nm值繼續(xù)增大時，表達(dá)量反而下降到36.2%。表明過早加入誘導(dǎo)劑，會使菌體很早就誘導(dǎo)表達(dá)p60蛋白，增加菌體的負(fù)擔(dān)，不利于細(xì)菌的生長繁殖。而加入過遲，細(xì)菌生長開始次級代謝，且培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不夠，不利于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。因此在OD600nm為0.77時，最適宜菌體的生長與p60蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.2 不同IPTG濃度對蛋白表達(dá)量的影響

圖2 IPTG濃度對p60蛋白表達(dá)量影響的SDS-PAGE分析Fig.2 Effect of final IPTG concentration on expression of p60 protein examined by SDS-PAGE

如圖2所示，IPTG濃度為0～1mmol/L時，蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)劑濃度增大而增加，p60蛋白表達(dá)量可達(dá)到38.9%，但再增加IPTG濃度，表達(dá)量反而下降到36.1%。說明當(dāng)IPTG濃度增加時，促進(jìn)p60蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。但濃度過高，會使菌體負(fù)荷過大，對菌體造成了毒害作用，不利于菌體的生長，而使蛋白表達(dá)量減少。所以IPTG誘導(dǎo)p60蛋白表達(dá)的最佳濃度可選擇為1mmol/L。

2.3 誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)量的影響

如圖3所示，在加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后，蛋白的表達(dá)量隨時間的延長而增加，當(dāng)誘導(dǎo)時間在0～6h之間時，蛋白表達(dá)量與菌體量均隨時間延長而增加，在6h時表達(dá)量達(dá)到40.3%，菌體量達(dá)到6.49g/L，而6～7h之間，表達(dá)量略微增加到40.8%，但菌體量下降到6.41g/L?？赡苁怯捎谥亟M菌在誘導(dǎo)后，大量的能量會消耗在外源蛋白的表達(dá)上，致使菌體的生長提前進(jìn)入衰亡期，如果不及時收獲會造成溶菌現(xiàn)象的發(fā)生。因此選擇最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間為6h。

圖3 誘導(dǎo)時間對p60蛋白表達(dá)量影響的分析Fig.3 Effect of induction time on expression of p60 protein examined by SDS-PAGE

2.4 誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式的影響

實驗過程中為了比較不同培養(yǎng)溫度對p60蛋白表達(dá)的影響，將可溶性p60蛋白生產(chǎn)能力定義為上清液中p60蛋白占總蛋白含量×終濃度OD600nm值[14-15]，以觀察可溶性p60蛋白表達(dá)量的變化。如表1所示，隨著溫度的升高，上清液中p60蛋白在總蛋白中的含量逐漸降低，在37℃時達(dá)13.91%，而在沉淀中的含量逐漸增加到9.24%。隨著溫度的升高，菌體濃度(OD600nm值)先增大后減小，這說明重組菌在較高的溫度下生長較快，適當(dāng)降低溫度有利于產(chǎn)物的表達(dá)和增加產(chǎn)物可溶性。而溫度過高時，菌體的比生長速率較高，培養(yǎng)過程中容易積累代謝副產(chǎn)物，反過來又抑制菌體的生長和目的產(chǎn)物的表達(dá)[16-17]，綜合比較溫度對菌體生長速率與蛋白可溶性的影響，選擇25℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式的影響

表1 誘導(dǎo)溫度對p60蛋白表達(dá)量及可溶性的影響Table 1 Effect of induction temperature on production and solubility of p60 protein

表2 搖床轉(zhuǎn)速對p60蛋白表達(dá)量及可溶性的影響Table 2 Effect of shaker speed on production and solubility of p60 protein

如表2所示，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，上清液中p60蛋白占總蛋白的含量逐漸降低，在200r/min時達(dá)15.43%，而在沉淀中的含量逐漸增加到8.89%。培養(yǎng)時的轉(zhuǎn)速會影響培養(yǎng)基中的溶氧量、影響細(xì)菌的生長速率和蛋白表達(dá)的速率，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150r/min時，供氧量適中，滿足了重組菌的生長需求，所以重組菌的生長和重組蛋白的表達(dá)情況良好，當(dāng)?shù)娃D(zhuǎn)速(100r/min)時，不能保證充足的供氧，重組菌生長慢，p60蛋白表達(dá)情況不佳。當(dāng)高轉(zhuǎn)速(200r/min)時，供氧量過大，菌體的比生長速率較高，培養(yǎng)過程中容易積累代謝副產(chǎn)物，且因生長速率過快，容易使目的蛋白沒有足夠的時間進(jìn)行正確折疊而形成包涵體，影響目的蛋白的可溶性。綜合比較轉(zhuǎn)速對菌體生長速率與蛋白可溶性的影響，選擇150r/min為誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的最佳轉(zhuǎn)速。

2.6 最佳誘導(dǎo)條件下的p60蛋白的表達(dá)分析

綜合上述各優(yōu)化條件，選擇在重組菌OD600nm為0.7～0.8時，加入濃度為1mmol/L的IPTG，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)表達(dá)6h，可得到重組表達(dá)的p60蛋白占總蛋白的含量為42.32%，其中可溶性蛋白占總p60蛋白含量的85.36%左右，為p60蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件。

3 討 論

基因工程菌株培養(yǎng)與發(fā)酵的目的是希望其外源基因能夠高水平表達(dá)，以便獲得大量的外源基因產(chǎn)物。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白可占菌體總蛋白的10%～50%，其表達(dá)產(chǎn)物通常以可溶和不可溶(即包涵體)形式存在，為了提高目的蛋白的活性和質(zhì)量，就要選擇合適的條件，盡量讓目的蛋白以可溶形式表達(dá)，減少無活性的不可溶的包涵體的產(chǎn)生[18]，同時也免去了變性與復(fù)性的純化過程，使蛋白純化更簡便、更經(jīng)濟。另外，可溶表達(dá)形式的外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中能正確折疊，從而獲得特定空間結(jié)構(gòu)和生物功能，最終獲得高純度、高活性的目的蛋白[19]。

本研究在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p60和獲得重組宿主菌BL21(DE3)的基礎(chǔ)上[20]，進(jìn)一步研究重組菌的培養(yǎng)條件，對重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)p60蛋白時的誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和搖床轉(zhuǎn)速5個因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得了p60蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件，得到的重組p60蛋白有較高的表達(dá)量和較好的可溶性。

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Optimization of Expression Conditions for Listeria monocytogenes p60 Protein

LU Tian，CAO Zheng-mao，WU Hai-tao，WANG Xiao-hong*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this study, the optimal conditions for the expression of Listeria monocytogenes p60 protein, for which the recombinant expression vector pET-28a-p60 and the recombinant E. coli BL21(DE3) host strain were available, were investigated. The results showed that the optimal expression process determined was that the host strain was enriched to a OD600nmvalue between 0.7 and 0.8, and IPTG was then added to a final concentration of 1 mmol/L, followed by 6 h expression on a shake table with a shaking speed of 150 r/min at 25 ℃, and that after the expression, the content of p60 protein as a percentage of total protein content was 42.32%, and soluble protein occupied around 85.36% of the total p60 protein.

Listeria monocytogenes；p60 protein；expression condition；optimization

Q815

A

1002-6630(2010)23-0160-04

2010-01-24

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)“國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃”資助項目(200837)

呂添(1989-)，男，本科生，研究方向為食品安全。E-mail：lvtian@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：王小紅(1970-)，女，副教授，博士，研究方向為食品微生物和食品安全。E-mail：wxh@mail.hzau.edu.cn