許振偉，許 鐘，楊憲時,*，郭全友，李學英

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

大黃魚中復合腐敗菌腐敗能力的分析

許振偉1,2，許 鐘1，楊憲時1,*，郭全友1，李學英1

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

通過分析接種腐敗菌的大黃魚無菌魚塊在貯藏中的感官、腐敗代謝產物和腐敗菌的變化，以腐敗菌生長動力學參數和腐敗代謝產物產量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)為指標，探討冷藏大黃魚優(yōu)勢腐敗菌(腐敗希瓦氏菌、假單胞菌以及這兩種菌的復合菌)的腐敗能力。結果表明，接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復合菌的無菌魚塊的貨架期分別為168、174、168h，說明接種假單胞菌的貨架期較長。腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復合菌的YTVB-N/CFU基本一致，腐敗希瓦氏菌的YTMA/CFU明顯大于假單胞菌和復合菌，腐敗希瓦氏菌的腐敗能力較假單胞菌和復合菌強。假單胞菌對腐敗希瓦氏菌的生長有一定的拮抗作用，但僅在較高數量時才有明顯作用，腐敗希瓦氏菌是有氧冷藏養(yǎng)殖大黃魚的特定腐敗菌。

大黃魚；優(yōu)勢腐敗菌；腐敗能力；腐敗希瓦氏菌；假單胞菌

微生物活動是引起鮮魚腐敗變質的主要原因，已有研究表明，魚體所含微生物中只有部分參與腐敗過程，這些適合生存和繁殖并產生強烈異臭味腐敗代謝產物的微生物，就是該魚的特定腐敗菌(specific spoilage organisms，SSO)[1]。特定腐敗菌比其他微生物生長快，并且腐敗能力強[2]，因此可采用抑制或降低特定腐敗菌生長的處理和加工方法，即使不影響其他微生物群落，也會延長產品貨架期[3]，這為開發(fā)魚類保鮮技術提供了

新的思路。

郭全友等[4]對冷藏東海暖水海域養(yǎng)殖大黃魚進行研究，貨架期終點時腐敗希瓦氏菌比例達86%，其次是假單胞菌，表明腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是低溫貯藏大黃魚的優(yōu)勢腐敗菌。李學英等[5]對大黃魚腐敗希瓦氏菌腐敗能力進行了初步分析，表明腐敗希瓦氏菌具有很強的腐敗潛力，但腐敗活性低，需要較高濃度才能引起腐敗。魚類特定腐敗菌的鑒別必須分析比較優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力。本實驗將有氧冷藏大黃魚在貨架期終點分離、純化、鑒定得到的優(yōu)勢腐敗菌腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，分別接種到無菌魚塊中，比較這兩種菌單一的腐敗能力，并將這兩種腐敗菌按比例混合，分析對無菌魚塊的腐敗能力，探討兩種優(yōu)勢腐敗菌在參與腐敗的過程中是拮抗、協(xié)同或是共生作用[6]，旨在分析復合菌大黃魚優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力，為魚類特定腐敗菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活大黃魚購于上海銅川路水產批發(fā)市場，個體大小600～700g/尾，充氧?；钸\送到實驗室。立即冰水休克致死，用自來水沖洗魚體，去頭、去鱗、去內臟、去鰭，清洗干凈，用于制備無菌魚塊。

半微量定氮儀 國藥集團化學試劑有限公司；721型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Sanyo MIR 553低溫培養(yǎng)箱 日本三洋電器集團；DS-1高速組織搗碎機 上海精科實業(yè)有限公司；SEX-TJ凈化工作臺上海整新電子設備公司；L550/L530低速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

CM 559假單胞菌專用培養(yǎng)基(supplemented with SR 103) 英國OXOID Basingstoke公司；鐵瓊脂培養(yǎng)基 上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 無菌魚塊的制備

根據Herbert等[7]的方法，無菌操作制備無菌魚塊。

1.4 純菌液的制備與接種貯藏實驗

1.4.1 接種純菌液的制備

挑取實驗室保存的有氧冷藏大黃魚貨架期終點分離、純化、鑒定得到的腐敗希瓦氏菌(S h e w a n e l l a putrefaciens)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)純菌株，制備腐敗希瓦氏菌和假單胞菌純菌液[5]。

1.4.2 接種與貯藏實驗

參照文獻[5]中的接種方法，進行純菌液的接種與接種后的貯藏實驗。其中復合菌以腐敗希瓦氏菌和假單胞菌菌液體積比1:1接種。取濃度為108CFU/mL的各菌液5mL，加入45mL滅菌生理鹽水中，將該50mL菌液加入450mL滅菌生理鹽水中，即稀釋至106CFU/mL，將兩種菌液以1:1比例混勻用于接種。

將接種后的魚塊置于滅菌的瓷盤中，覆蓋有漏氣孔保鮮膜，放于高精度低溫培養(yǎng)箱中，控制貯藏溫度(5±0.1)℃。每隔6h或12h對接種的魚塊進行感官評價，揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)測定、三甲胺(trimethylamine，TMA)測定和腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和兩者的復合菌菌落計數。

1.5 測定方法

1.5.1 感官評價

由6名經過訓練的評價員組成感官評價小組，采用3分法對貯藏過程的接種魚塊進行感官評價，0分為最好品質，1分為魚塊的鮮香味消失，為高品質期(h i g h quality life，HQL)終點；2分為明顯出現異臭味，為貨架期(shelf life，SL)終點即感官拒絕點[8]。

1.5.2 TVB-N測定

參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中半微量定氮法測定。

1.5.3 TMA測定

參照GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的測定》和許龍福等[9]的修訂方法，采用苦味酸法測定。

1.5.4 細菌計數與培養(yǎng)基

稱取打碎魚肉25g，加入225mL質量分數0.1%蛋白胨無菌生理鹽水，高速振蕩，以10倍梯度稀釋后，取合適濃度稀釋液0.1mL，涂布于培養(yǎng)基表面，每個稀釋液做兩個平行。

復合菌：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，全部菌落計數。腐敗希瓦氏菌：鐵瓊脂培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，黑色菌落計數。假單胞菌：假單胞菌專用培養(yǎng)基，25℃有氧培養(yǎng)24h，全部菌落計數。

1.6 微生物生長動力學模型

用修正的Gompertz方程[10]描述微生物的生長動態(tài)。修正的Gompertz方程如下所示：

式中：N(t)為t時間的腐敗菌數量/(CFU/g)；N、Nmax為初始菌數和最大菌落數/(CFU/g)；μmax為最大比生長速率/h-1；Lag為延滯時間/h；t為時間/h。

1.7 腐敗能力的定量分析

以單位腐敗菌產生的腐敗代謝產物，作為腐敗能力的定量指標，腐敗代謝產物產量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)如下所示[5]：

式中：產量因子YTVB-N/CFU/(mg TVB-N/CFU)；YTMA/CFU/ (mg TMA/CFU)；N0為初始菌落數/(CFU/g)；NS為貨架期終點時的腐敗菌落數即最小腐敗菌落數/(CFU/g)；(TVB-N)0、(TVB-N)S為初始點和貨架期終點時的TVB-N量/(mg/100g)；(TMA)0、(TMA)S為初始點和貨架期終點時的TMA量/(mg/100g)。

1.8 數據處理

感官評價和TVB-N、TMA的變化用Microsoft Exc e l進行多項式回歸分析，腐敗菌生長采用修正的Gompertz方程描述，用Statistica 6.5進行非線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 貯藏中的感官變化

圖1 接種腐敗菌的無菌魚塊在5℃貯藏的感官變化Fig.1 Sensory quality change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

由圖1可知，接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌、復合菌的魚塊分別在84、96、96h達到高品質期終點，分別在168、174、168h達到感官拒絕點。

2.2 貯藏中TVB-N的變化

圖2 接種腐敗菌的無菌魚塊在5℃貯藏TVB-N的變化Fig.2 Total volatile base nitrogen change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

由圖2可知，接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復合菌的魚塊初始TVB-N值分別為8.71、8.81、8.55mg/100g。貯藏初期TVB-N值變化不明顯，隨著貯藏時間的延長，TVB-N值增加明顯。在120h前，三者的TVB-N值較接近，曲線變化基本一致，150h后接種腐敗希瓦氏菌和假單胞菌魚塊的TVB-N值明顯高于接種復合菌的TVB-N值。

2.3 貯藏中TMA的變化

圖3 接種腐敗菌的無菌魚塊在5℃貯藏TMA的變化Fig.3 Trimethylamine change in sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

由圖3可知，在貯藏初期TMA值幾乎接近于零，60h后接種腐敗希瓦氏菌和接種復合菌的魚塊TMA值隨著貯藏時間開始快速增加，其中接種腐敗希瓦氏菌魚塊的TMA值高于接種復合菌的TMA值；而接種假單胞菌魚塊的TMA值明顯較低，腐敗終點時TMA含量也很低。

2.4 貯藏中腐敗菌菌落數的變化

圖4 接種腐敗菌的無菌魚塊在5℃貯藏腐敗菌菌落數的變化Fig. 4 Microbial counts change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

采用修正Gompertz方程描述接種腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復合菌的生長動態(tài)是典型的S型曲線，所得回歸相關系數值均較高(R2分別為0.990、0.984、0.990)。由圖4可知，假單胞菌和復合菌的延滯時間較接近，二者明顯比腐敗希瓦氏菌的延滯時間短，這與李學英等[5]的研究相符。在貯藏初期魚塊營養(yǎng)物質豐富，腐敗希

瓦氏菌和假單胞菌的生長互不影響，此時屬于微生物生長中的共生作用，但隨著貯藏時間的延長和魚塊營養(yǎng)物質的不斷被消耗，兩種腐敗菌的生長出現競爭作用，假單胞菌對腐敗希瓦氏菌有一定的抑制作用，但抑制作用不明顯。

2.5 腐敗菌的生長動力學參數

表1 無菌魚塊5℃貯藏腐敗菌生長動力學參數Table 1 Microbial growth kinetic parameters of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 5 ℃

表1是腐敗菌生長動力學參數。通過比較可知，腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和復合菌的最大腐敗菌數(Nmax)都大于最小腐敗菌數(Ns)，表明三者都能引起大黃魚的腐敗。三者的最大比生長速率(μmax)分別為0.0927、0.0631h-1和0.0516h-1，其中腐敗希瓦氏菌的最大比生長速率明顯大于假單胞菌和復合菌，假單胞菌與復合菌的最大比生長率基本相一致。三者的延滯時間分別為41.1、21.1、15.2h，假單胞菌和復合菌的生長延滯時間明顯較腐敗希瓦氏菌短。

2.6 腐敗菌腐敗能力的定量分析

表2 接種腐敗菌的無菌魚塊在5℃貯藏腐敗菌的產量因子Table 2 Yield factors of TVBN and TMA production of spoilage bacteria inoculated sterile fish blocks stored at 5 ℃

由表2可知，三者的YTVB-N/CFU基本一致，腐敗希瓦氏菌的YTMA/CFU明顯大于假單胞菌的。通過比較接種腐敗菌的無菌魚塊貯藏初始點和出現明顯腐臭味時的感官評價、TVB-N、TMA值和腐敗菌數，腐敗菌的生長動力學參數、腐敗代謝產物的產量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)，大黃魚有氧低溫貯藏的兩種優(yōu)勢腐敗菌中腐敗希瓦氏菌的腐敗能力較假單胞菌強、復合菌強。

3 討 論

TMAO(trimethylamine oxide，氧化三甲胺)廣泛分布于海產硬骨魚類的肌肉中，是海產硬骨魚類具有的一種特殊鮮味物質。海水魚每100g魚肉組織中含1～100mg TMAO，而淡水魚肉一般僅含有5～20mg TMAO[11]。腐敗希瓦氏菌能將TMAO還原為TMA，而假單胞菌不能或還原TMAO能力非常弱[12]。Miller等[13]將熒光假單胞菌接種到無菌美洲平鲉魚塊中，腐敗點時測得TMA含量僅為0.5mg/100g。本研究中接種假單胞菌的魚塊測定的TMA含量也很低，腐敗點時含量僅為1.16mg/100g。

無菌魚塊可作為腐敗菌腐敗能力研究的基質，但無菌魚塊的無菌是相對而言的，無菌魚塊制備后菌落總數應小于102CFU/g[7]。Gram等[14]研究尼羅河新鮮和腐敗著的鱸魚細菌學時，將細菌接種到殺菌過的鱸魚和殺菌過的鱈魚肉湯中，通過其腐敗氣味，以確定其腐敗能力，用T M A O培養(yǎng)基來測試產生T M A和H2S的能力。Dalgaard[15]研究了包裝鱈魚的特定腐敗菌，得出磷發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的產量因子(YTMA/CFU)明顯大于腐敗希瓦氏菌的產量因子，磷發(fā)光桿菌是包裝鱈魚的特定腐敗菌。

郭全友等[16]對養(yǎng)殖大黃魚低溫有氧貯藏貨架期終點的腐敗菌進行鑒定，假單胞菌和腐敗希瓦氏菌是有氧冷藏海水魚的優(yōu)勢腐敗菌。假單胞菌在海水魚的腐敗中沒有很大的重要性，這可能是由于其數量相對較少，同高數量的腐敗希瓦氏菌競爭能力低[17]。Gram等[18]研究了熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌在鱸魚魚塊中的相互作用，得出熒光假單胞菌會抑制腐敗希瓦氏菌的生長，但這一相互作用僅在含較高濃度時才會影響腐敗希瓦氏菌生長。這與本研究的接種腐敗希瓦氏菌和假單胞菌兩種腐敗菌的復合菌的生長相一致，腐敗希瓦氏菌是冷藏大黃魚的特定腐敗菌，其腐敗能力強。

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Analysis of Spoilage Ability of Single and Mixed Spoilage Bacteria in Pseudosciaena crocea

XU Zhen-wei1,2，XU Zhong1，YANG Xian-shi1,*，GUO Quan-you1，LI Xue-ying1
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Sensory quality, metabolic products of spoilage bacteria and change of spoilage bacteria were assayed on sterile Pseudosciaena crocea tissue blocks inoculated with spoilage bacteria, with YTVB-N/CFU and YTMA/CFU, the growth kinetic parameters of the spoilage bacteria and the yield factor of microbial metabolites, respectively, used as the index. Spoilage ability of two spoilage bacteria Shewanella putrefaciens and Pseudomonas spp., as well as the mixing of the two spoilage bacteria were analyzed on Pseudosciaena crocea stored aerobically at chilled condition. The results showed that shelf life was 168 h, 174 h, and 168 h, respectively, for sterile tissue blocks inoculated with Shewanella putrefaciens, Pseudomonas spp. and their mixture, while it was relatively longer with Pseudomonas spp. The YTVB-N/CFUfor Shewanella putrefaciens, Pseudomonas spp. and mixed bacteria was basically similar, meanwhile YTMA/CFUfor Shewanella putrefaciens was higher than for Pseudomonas spp. and mixed bacteria. The spoilage ability of Shewanella putrefaciens was more significant than Pseudomonas spp. and mixed bacteria. Pseudomonas spp. had inhibitory effect on he growth of Shewanella putrefaciens to some extent, however it was not significant until it reached high counts. Shewanella putrefaciens was specific spoilage organism in Pseudosciaena crocea stored at chilled temperature aerobically.

Pseudosciaena crocea；dominant spoilage bacteria；spoilage ability；Shewanella putrefaciens；Pseudomonas spp.

S983

A

1002-6630(2010)23-0118-05

2010-03-21

國家自然科學基金項目(30771675)；科技部農業(yè)科技成果轉化資金項目(2007GB23260281)；科技部中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項 (2007M05)

許振偉(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品微生物安全與質量控制研究。E-mail：xuzhenweixu@163.com

*通信作者：楊憲時(1954—)，男，研究員，本科，主要從事水產品貯藏加工與品質控制研究。E-mail：xianshiyang@126.com