楊 芳，王新風,*，翁 良，戈群妹，陳珊珊

(1.淮陰師范學院生命科學學院 資源微生物研究所，江蘇 淮安 223300；2.江蘇省生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 淮安 223300)

兩種羊肚菌胞內(nèi)多糖體外抗氧化性

楊 芳1,2，王新風1,2,*，翁 良1，戈群妹1，陳珊珊1

(1.淮陰師范學院生命科學學院 資源微生物研究所，江蘇 淮安 223300；2.江蘇省生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 淮安 223300)

用水提醇沉法提取北京羊肚菌(MB)和淮陰羊肚菌(MH)菌絲體胞內(nèi)多糖(IPS1)，經(jīng)脫色及脫蛋白得純化多糖(IPS2)。采用水楊酸法測定IPS1和IPS2對·OH 的清除作用；鄰苯三酚自氧化法測定IPS1和IPS2對O2·的抑制作用。結(jié)果表明： IPS1和IPS2均能明顯地清除·OH和抑制O2·的能力，在1～5mg/mL質(zhì)量濃度范圍，抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增加而增加。MB和MH提取的IPS1和IPS2清除O2·能力差異不顯著，MB和MH提取的IPS1清除·OH能力的差異也不顯著，MH提取的IPS1和IPS2之間清除·OH能力差異顯著，質(zhì)量濃度為5mg/mL時，IPS1清除能力只有22.57%，而IPS2清除能力高達46.27%，表明MH的胞內(nèi)多糖的清除·OH能力明顯高于MB胞內(nèi)多糖。

羊肚菌；胞內(nèi)多糖；抗氧化性

羊肚菌(Morchella esculenta L.)隸屬子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱(Discomycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)，因其菌蓋表面呈許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名。羊肚菌又名羊肚菜，是一種野生名貴食藥用真菌，最早收錄于李時珍的《本草綱目》[1]。羊肚菌性平、味甘。能益腸胃、化痰理氣，是一種良好的中藥。近來研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌富含多糖。真菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤功能。免疫調(diào)節(jié)作用是大多數(shù)活性多糖的共同特性[2-3]，也是它們發(fā)揮其他生理和藥理作用(如抗腫瘤)的基礎(chǔ)。許多多糖都是哺乳動物的免疫調(diào)節(jié)劑[4]。真菌多糖并不能直接殺死腫瘤細胞，但卻

可以刺激機體免疫能力，從而達到抑制腫瘤細胞增生的目的[5]。因此真菌多糖具有極其重要的利用與開發(fā)價值。羊肚菌胞內(nèi)多糖(IPS)是羊肚菌的重要活性成分，本實驗室以羊肚菌胞內(nèi)多糖為研究對象，對兩種不同來源羊肚菌進行胞內(nèi)多糖(IPS1和IPS2)抗氧化性進行研究，為今后更好的利用與開發(fā)羊肚菌多糖抗氧化功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羊肚菌(Morchella esculent L.)母種分別購自中國農(nóng)業(yè)大學食用菌研究室(MB)和采集分離自江蘇盱眙的母種(MH)。

1.2 試劑

蒽酮、95%乙醇、水楊酸、過氧化氫、FeSO4· 7H2O、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，以上試劑均為分析純 淮安國藥化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TDL-5000B離心機 上海安亭科學醫(yī)學儀器廠；BS210S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；HD-930型組合式全溫搖床 江蘇太倉市實驗儀器廠；水浴鍋 金壇市正基儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 羊肚菌胞內(nèi)多糖浸提和純化[6]

精確稱取已研磨好的干菌絲，按加水比50:1(V/m)加入蒸餾水，搖勻后，85℃恒溫水浴浸提2h后取出，用濾紙過濾，殘渣再重新提取一次，合并提取液。提取液分兩步制備羊肚菌多糖：直接經(jīng)醇沉法制得羊肚菌胞內(nèi)粗多糖(IPS1)；經(jīng)5% H2O2脫色和Sevag法脫蛋白后，再醇沉、真空干燥得羊肚菌精多糖(IPS2)。

1.4.2 羊肚菌多糖測定

采用蒽酮比色法，參考文獻[7]。

1.4.3 羊肚菌中各種提取液對·OH的清除率的測定[8-10]

將IPS1和IPS2配制成一系列梯度濃度的液體，采用水楊酸法測定IPS1和IPS2對·OH清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度；AX為加入待測溶液后的吸光度；AX0為待測溶液的本底吸光度。

1.4.4 羊肚菌中各種提取液對O2·清除率的測定[11-12]采用鄰苯三酚自氧化法，取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5mL于試管中，置25℃水浴中預(yù)熱20min，加入0.1mL各供試液，2.5mmol/L鄰苯三酚0.4mL，混勻后在25℃水浴中準確反應(yīng)4min，立即用8mol/L 0.1mL HCl終止反應(yīng)，并在299nm波長處測定吸光度(以蒸餾水調(diào)零)，對照組用0.1mL蒸餾水代替供試液，同時設(shè)立試劑空白管。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)3次平行，數(shù)值采用(x±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌胞內(nèi)多糖IPS1和IPS2的含量

表1 兩種羊肚菌中IPS1和IPS2的含量Table 1 Contents of IPS1 and IPS2 in the mycelia ofMorchella esculentL. from Beijing and Huaiyin

由表1可知，比較兩種羊肚菌中胞內(nèi)多糖IPS1和IPS2的含量， MH大于MB。經(jīng)脫色與脫蛋白純化后得到的IPS2與未經(jīng)純化的IPS1之間差距不是很大，后者分別是前者的89.73%和84.62%，說明在粗多糖中蛋白的含量并不多。

2.2 MB中胞內(nèi)多糖對O2·和·OH的清除率

表2 MB中IPS1和IPS2對O2·和·OH的清除率Table 2 Scavenging rates of CIPSMBand PIPSMBon hydroxyl and superoxide anion free radicals

由表2得知，隨著MB中胞內(nèi)多糖質(zhì)量濃度的增加，抑制O2·和清除·OH的能力也都是逐漸增加。清除自由基能力最強是多糖含量為5mg/mL，此時IPS1和IPS2抑制O2·能力分別是61%和73.083%，清除·OH能力分別是24.46%和22.57%。運用DPS軟件，采用定量數(shù)據(jù)機率分析方法，得IPS1對O2·的EC50質(zhì)量濃度是0.0963mg/mL，IPS2對O2·的EC50質(zhì)量濃度是0.0002mg/mL，且二者清除率回歸方程的方差分析F值的顯著水平P值分別為0.0029和0.0051。IPS1對·OH的EC50質(zhì)量濃度是123.9529mg/mL，IPS2對·OH的EC50質(zhì)量濃度是48.3226mg/mL，且二者質(zhì)量濃度對數(shù)與清除率回歸方程的方差分析表明，F(xiàn)值的顯著水平P＜0.05(分別為0.00292和0.0051)。說明純化

后的多糖清除自由基的能力要強于粗多糖。

2.3 MH中胞內(nèi)多糖對O2·和·OH的清除率

表3 MH中IPS1和IPS2對O2·和·OH的清除率Table 3 Scavenging rates of CIPSMHand PIPSMHon hydroxyl and superoxide anion free radicals

由表3可知，隨著MH胞內(nèi)多糖質(zhì)量濃度的增加，抑制O2·和清除·OH的能力也都是逐漸增加。清除自由基能力最強是多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL，此時IPS1和IPS2抑制O2·能力分別是63.063%和73.167%，清除·OH能力分別是21.05%和46.27%。運用DPS軟件，采用定量數(shù)據(jù)機率分析方法，得IPS1對O2·的EC50質(zhì)量濃度是0.0440mg/mL，IPS2對O2·的EC50質(zhì)量濃度是0.0007mg/mL，且二者清除率回歸方程的方差分析F值的顯著水平P值分別為0.0008和0.0064。IPS1對·OH的EC50質(zhì)量濃度是346.5629mg/mL，IPS2對·OH的EC50質(zhì)量濃度是7.9611mg/mL，且二者質(zhì)量濃度對數(shù)與清除率回歸方程的方差分析表明，F(xiàn)值的顯著水平P＜0.05 (分別為0.0239和0.0088)。說明純化后的多糖清除自由基的能力要強于粗多糖。

2.4 VC標準品對自由基的清除作用

表4 VC標準品對O2·和·OH的清除率Table 4 Scavenging rates of vitamin C standard on hydroxyl and superoxide anion free radicals

3 討 論

多糖分子上均具有還原性的半縮醛羥基，可與氧化劑活性氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)[13]。羊肚菌胞內(nèi)多糖(IPS1和IPS2)具有很強的抗氧化能力，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對O2·的清除中其清除能力與多糖的純度和質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，多糖的純度越高，質(zhì)量濃度越大其抗氧化能力越強。經(jīng)純化后的北京羊肚菌多糖溶液在質(zhì)量濃度達1mg/mL時，其清除能力為70.406%，在質(zhì)量濃度從1mg/mL增加到5mg/mL過程中其清除能力只增加不到3%，因而認為當多糖溶液的質(zhì)量濃度達到一定的范圍時，羊肚菌多糖對O2·的清除能力增效不明顯，它們之間不存在完全的劑量效應(yīng)?；搓幯蚨蔷拇侄嗵呛图兓蠖嗵侨芤簩2·的清除能力與北京羊肚菌非常相似，兩者間的差異不顯著(P=0.08391，0.76838)。

·OH被認為是毒性最強的活性氧自由基，它比高錳酸鉀和重鉻酸鉀的氧化性還強；它的反應(yīng)性極強，壽命極短，對機體的破壞作用最大，是造成生物有機體過氧化損傷的主要因素。它可以引發(fā)組織細胞病變，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生和加速機體的衰老[14-15]。羊肚菌多糖對·OH有明顯的清除作用，淮陰羊肚菌和北京羊肚菌的粗多糖和經(jīng)脫蛋白純化后的多糖對·OH的清除率在同樣質(zhì)量濃度下，都較O2·的清除能力低，粗多糖在1～5mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的清除能力，兩種羊肚菌都在13%～24%之間；而經(jīng)脫蛋白后得到的純化多糖的清除率淮陰羊肚菌的純多糖明顯高于粗多糖，但北京羊肚菌的純化后的多糖對·OH的清除能力卻不隨著純度的提高而提高，分析其原因可能因為種間的差異導(dǎo)致的多糖結(jié)構(gòu)表征不同的影響或北京羊肚菌粗多糖中存在與多糖有協(xié)同清除·OH作用的蛋白。

由兩種來源的羊肚菌粗多糖經(jīng)脫蛋白純化后得到純化多糖的得率分別是84.62%(MB)和89.73%(MH)，淮陰羊肚菌的多糖抗氧化能力優(yōu)于北京羊肚菌，經(jīng)脫蛋白純化的多糖抗氧化能力優(yōu)于粗蛋白。以VC的抗氧化性為參照，無論是淮陰羊肚菌還是北京羊肚菌，其5mg/mL的粗多糖溶液的抗氧化性都低于1mg/mL的VC標準對照組，只有淮陰羊肚菌純化后的多糖在清除·OH時2mg/mL多糖溶液相當于0.1mg/mL的VC標準對照組。因此淮陰羊肚菌純化后的多糖抗氧化能力更強、更經(jīng)濟、更具開發(fā)價值。

[1]李娟, 王臻, 姚良同, 等. 羊肚菌多糖研究進展[J]. 微生物學雜志, 2005, 25(4): 89-91.

[2]NEYTS J, SNOECK R, SCHOLS D, et al. Selective inhibition of human cytomegalovirus DNA synthesis by (S)-1-(3-Hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl)cytosine [(S)-HPMPC] and 9-(1,3-Dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine (DHPG)[J]. Virology, 1990, 179(1): 41-50.

[3]SCHOLS D, PAUWELS R, WITVROUW M, et al. Differential activity of polyanionic compounds and castanospermine against HIV replication and HIV-induced syncytium formation depending on virus strain and cell type[J]. Chemistry & Chemotherapy, 1992, 3(1): 23-29.

[4]周靚, 蒙義文. 多糖及其衍生物抗病毒作用研究進展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學報, 1997, 3(1): 82-90.

[5]周國英, 蘭貴紅, 何小燕. 食用菌多糖研究開發(fā)進展[J]. 實用預(yù)防醫(yī)學, 2004, 11(1): 203-204.

[6]武秋立, 安家彥. 羊肚菌多糖提取、分離條件的選擇[J]. 食品科學, 2005, 26(1): 116-120.

[7]李群. 蒽酮比色法測定羊肚菌多糖及實驗評價[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2000, 10(1): 31-32.

[8]陳留勇, 孟憲軍, 賈薇, 等. 黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基提高免疫活性研究[J].食品科學, 2004, 25(2): 167-170.

[9]SMIRONFF N, CUMBESQ J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry, 1989, 28(4): 1057-1060.

[10]馬曉華, 連賓. 幾種常見食用菌清除羥自由基能力的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(10): 25-29.

[11]劉剛, 王輝, 張先洲, 等. 青藤堿清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用[J]. 中草藥, 2006, 37(1): 85-89.

[12]王巨存, 邢國勝, 胡文鐸, 等. 有機鍺Ge-132對氧自由基和由羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的影響[J]. 中國藥學雜志, 1994, 29(1): 23-25.

[13]郭華, 侯冬巖, 回瑞華, 等. 環(huán)棱褐孔菌多糖的提取、含量測定及抗氧化性分析[J]. 時針國醫(yī)國藥, 2006, 17(5): 729-730.

[14]芮海云, 吳國榮, 陳景耀, 等. 白芨中性多糖抗氧化作用的實驗研究[J]. 南京師范大學學報, 2003, 6(4): 94-98.

[15]鄭琳, 蒲訓(xùn), 畢玉蓉. 白阿魏側(cè)耳子實體抗氧化活性的研究[J]. 中國食用菌, 2002, 22(1): 23-26.

Antioxidant Activity of Intracellular Polysaccharides (IPS) from Morchella esculenta L.

YANG Fang1,2，WANG Xin-feng1,2,*，WENG Liang1，GE Qun-mei1，CHEN Shan-shan1
(1.Institute of Resource Microorganism, College of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huai an 223300, China；2. Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechology around Hongze Lake, Huai an 223300, China)

The crude intracellular polysaccharides (CIPSMBand CIPSMH) extracted from the mycelia of Morchella esculenta L. from Beijing (MB) and Huaiyin (MH) areas by water extraction and alcohol precipitation were subjected to decolorization and deproteinization to obtain purified CIPSMBand CIPSMH, denoted as PIPSMBand PIPSMH, respectively. The scavenging effects of the four samples on hydroxyl and superoxide anion free radicals were tested by salicylic acid method and pyrogallol autoxidation method, respectively. It was observed that all the four samples were able to obviously scavenge both free radicals, displaying a positive concentration-dependent response in a concentration range between 1 mg/mL and 5 mg/mL. No statistical significance in the ability to scavenge superoxide anion free radicals was found between CIPSMBand PIPSMBand between CIPSMHand PIPSMH. CIPSMBand CIPSMHhad no significant difference in the ability to scavenge hydroxyl free radicals. However, there was a significant difference in the ability to scavenge hydroxyl free radicals observed between CIPSMHand PIPSMH; the scavenging rate of CIPSMHat a concentration of 5 mg/mL was only 22.57%, whereas that of PIPSMHwas as high as 46.27%, indicating that purification greatly enhances the hydroxyl free radical scavenging capacity of intracellular polysaccharides from the mycelia of Morchella esculenta L. from Huaiyin area.

Morchella esculenta L.；intracellular polysaccharide；antioxidant activity

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0076-03

2010-09-13

江蘇省教育廳高新產(chǎn)業(yè)項目(JHZD04-006)；江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練項目(JSDXS20090212)；淮陰師范學院教授基金項目(08HSJSK05)

楊芳(1983—)，女，碩士，主要從事真菌生理生化研究。E-mail：yangfang072@126.com

*通信作者：王新風(1964—)，男，教授，學士，主要從事食品微生物研究。E-mail：wangxf@hytc.edu.cn