樊金娟，付巖松，宗立立，張心昱，羅 霞，朱延姝

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100101；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

米糠抗氧化肽的抗衰老作用

樊金娟1，付巖松1，宗立立3，張心昱2，羅 霞1，朱延姝1

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100101；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

利用D-半乳糖(D-gal)致衰老小鼠模型，探討米糠抗氧化肽對(duì)小鼠心、腦線粒體過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和總?cè)姿嵯佘彰?T-ATPase)活性的影響，并通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和光密度掃描檢測(cè)該肽對(duì)小鼠腦線粒體DNA(mtDNA)缺失突變的影響。結(jié)果顯示：與衰老組相比，高劑量 (500mg/kg bw) 米糠抗氧化肽可顯著提高致衰老小鼠心腦線粒體CAT、GSH-Px 、SDH以及T-ATPase活性(P＜0.05)，明顯降低腦mtDNA缺失突變水平(P＜0.01)，效果優(yōu)于中、低劑量。結(jié)論：米糠抗氧化肽能夠提高D-gal致衰老小鼠的抗氧化能力，對(duì)mtDNA具有良好的保護(hù)作用。

米糠抗氧化肽；線粒體DNA(mtDNA)；抗衰老

隨著世界人口老齡化趨勢(shì)的加重，如何提高生存質(zhì)量、延年益壽越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。生物活性肽具有抗氧化損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、預(yù)防與年齡相關(guān)疾病等多種生理功能，適當(dāng)補(bǔ)充活性肽對(duì)于延緩衰老具有重要意義。

米糠是稻米加工后的副產(chǎn)物，蛋白含量高，必需氨基酸組成合理。已發(fā)現(xiàn)米糠肽具有多種生理活性，如抗氧化[1]、降血壓[2]、調(diào)節(jié)免疫及類阿片拮抗[3]等作用。但就其抗衰老作用的詳細(xì)深入研究較鮮見(jiàn)。

近年來(lái)研究表明，線粒體在結(jié)構(gòu)和功能上有很多增齡性變化，mtDNA突變?cè)诮M織細(xì)胞衰老過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以往工作基礎(chǔ)，以自由基損傷學(xué)說(shuō)為切入點(diǎn)，考察米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心、腦線粒體CAT、GSH-Px、SDH、T-ATPase活性及腦mtDNA缺失情況的影響，旨在為肽類抗衰老食品、保健品等的開(kāi)發(fā)以及米糠的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，由沈陽(yáng)千重浪稻業(yè)提供。

昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，由長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

總蛋白定量(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)試盒，CAT、GSH-Px、SDH、超微量ATP酶活性測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；Taq DNA聚合酶 TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Biowet公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；TC-512型PCR儀 英國(guó)Techne公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；T2A型凝膠成像儀BIO-RAD公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；D-37520 Osterode臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠抗氧化肽的制備

按本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行[4]，采用AS1.398中性蛋白酶，在pH7.0、溫度55℃、[E]/[S]為12%條件下酶解米糠蛋白6h，4000r/min離心10min，獲得米糠抗氧化混合肽。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理

標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)小鼠一周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。將60只小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，雌雄各半，分別為：對(duì)照組，衰老組，米糠抗氧化肽低、中、高劑量治療組。衰老組和米糠肽各治療組每日按100mg/kg bw頸背部皮下注射D-gal，對(duì)照組注射等量生理鹽水；米糠肽低、中、高劑量治療組每日分別灌胃米糠抗氧化肽100、200、500mg/(kg bw·d)。每日定時(shí)灌胃、注射一次，連續(xù)6周，期間按性別一組兩籠，自由飲食飲水，觀察小鼠體征，每周稱量體質(zhì)量一次。

末次給藥次日，所有小鼠脫頸椎處死，迅速取腦、心臟，冷生理鹽水沖洗、濾紙吸干，于液氮速凍，-7 0℃保存，備用。

1.3.3 線粒體的制備

冰浴中制備10%的心、腦肌組織勻漿，4℃、2000r/min離心10min，取上清10000r/min離心15min，沉淀物即為線粒體。將分離的線粒體用冰冷的勻漿介質(zhì)制成混懸液，超聲波破碎線粒體膜，用于生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.4 腦mtDNA缺失的檢測(cè)

[5]提取mtDNA，參照小鼠mtDNA全序列[6]及文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)的引物序列，共用5個(gè)引物(由金思特科技南京有限公司合成)：L1、L2、P1、P2和H。引物序列及位置：L18858 TCTATTCATCGTCTCGGAAG 8877；L212883 TACCATTCCTAACAGGGTTC 12902； H 13354 TTTATGGGTGTAATGCGGTG 13335；P18955 CCTCCAACAGGAATTTCACC 8974；P213092 AATGCTAGGCGTTTGATTGG 13111。L1、L2橫跨mtDNA常見(jiàn)缺失區(qū)，運(yùn)用巢式PCR法，L1/H、P1/P2用于擴(kuò)增缺失型mtDNA片段，產(chǎn)物304bp反映缺失型mtDNA (3867bp)的含量，L2/H用于擴(kuò)增野生型mtDNA片段，產(chǎn)物472bp反映正常mtDNA的含量。

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：參照文獻(xiàn)[8]方法略有改動(dòng)，其中以P1/P2為引物時(shí)的退火溫度56℃。每個(gè)樣本缺失型和野生型片段各擴(kuò)增3次。

產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色。運(yùn)用JD-801專業(yè)數(shù)碼凝膠圖像分析軟件3.3，取得各條帶積分光密度，分別以3次擴(kuò)增條帶的平均積分光密度值代表各PCR產(chǎn)物的含量。計(jì)算缺失型mtDNA與野生型mtDNA的光密度比值，比較各組缺失差異。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

組織蛋白含量、CAT、GSH-Px、SDH、T-ATPase活性按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著差法(LSD)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠體征表現(xiàn)的影響

與對(duì)照組相比，衰老組小鼠連續(xù)頸背部皮下注射D-gal 3周后逐漸出現(xiàn)毛色暗淡發(fā)黃，松散無(wú)光澤，脊背隆起，皮膚松懈，食欲減退，形體瘦弱，自發(fā)活動(dòng)減少，行動(dòng)遲緩，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍等衰老體征，并隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)愈明顯。與衰老組相比，米糠抗氧化肽各組隨劑量增高，小鼠毛色、形體、食欲、精神狀態(tài)及反應(yīng)靈敏度等情況逐漸得以改善，其中高劑量組與對(duì)照組相比基本無(wú)差別。

圖1 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of rice bran antioxidant peptides on body weight of aging mice induced byD-gal

2.2 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量的改變是衰老變化的重要生理指標(biāo)之一。從圖1可以看出，處理第1周，各組小鼠體質(zhì)量均增加迅速，而處理第2周，小鼠體質(zhì)量增加量有所下降，而后又逐漸回升?？赡苁怯捎诠辔覆僮鲗?duì)動(dòng)物食道有一定刺激，影響其食欲，但經(jīng)過(guò)一定的適應(yīng)期又逐漸得到恢復(fù)，其中高劑量組接近對(duì)照組。而與對(duì)照組和米糠抗氧化肽組相比，衰老組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其進(jìn)食量逐漸減少，實(shí)驗(yàn)后期體質(zhì)量有所下降。

2.3 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心腦線粒體CAT、GSH-Px活性的影響

表1 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心、腦線粒體CAT活性的影響Table 1 Effect of rice bran antioxidant peptides on the activity of CAT in mitochondria of heart and brain in aging mice induced byD-gal

表2 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心、腦線粒體GSH-Px活性的影響Table 2 Effect of rice bran antioxidant peptides on the activity of GSH-Px in mitochondria of heart and brain in aging mice induced byD-gal

由表1、2可知，衰老組小鼠心腦線粒體CA T、GSH-Px活性較對(duì)照組顯著下降(P＜0.05)；米糠抗氧化肽低、中、高劑量組小鼠心腦線粒體CAT、GSH-Px活性較衰老組則有不同程度提高，高劑量組提高水平顯著(P＜0.05)，而低劑量組小鼠GSH-Px活性與對(duì)照組相比仍差異顯著(P＜0.05)。說(shuō)明米糠抗氧化肽能夠提高致衰老小鼠抗氧化酶活性，增強(qiáng)其清除自由基能力，并呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心腦線粒體SDH、T-ATPase活性的影響

表3 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心、腦線粒體SDH活性的影響Table 3 Effect of rice bran antioxidant peptides on the activity of SDH in mitochondria of heart and brain in aging mice induced byD-gal

表4 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠心、腦線粒體T-ATPase活性的影響Table 4 Effect of rice bran antioxidant peptides on the activity of TATPase in mitochondria of heart and brain in aging mice induced byD-gal

SDH處于呼吸鏈第二位，是線粒體的標(biāo)志酶，其活性高低直接影響ATP的合成。ATPase存在于組織細(xì)胞和細(xì)胞器的膜上，其活力大小是各種細(xì)胞能量代謝及功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)。由表3、4可知，衰老組SDH、T-ATPase活性較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)；而米糠抗氧化肽各組SDH、T-ATPase活性較衰老組均有不同程度地提高，其中高劑量組提高明顯(P＜0.05)，但與對(duì)照組相比低劑量組仍有顯著差異(P＜0.05)。說(shuō)明米糠抗氧化肽具有提高致衰老小鼠能量代謝的作用，并呈量效關(guān)系。

2.5 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠腦mtDNA缺失的影響

圖2 小鼠腦mtDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose electrophoresis of PCR products of mtDNA from brain mitochondria of aging mice induced byD-gal

表5 米糠抗氧化肽對(duì)D-gal致衰老小鼠腦mtDNA缺失的影響Table 5 Effect of rice bran antioxidant peptides on mtDNA deletion in brain mitochondria of aging mice induced byD-gal

由圖2及表5可知，對(duì)照組僅個(gè)別出現(xiàn)缺失，且缺失量很少；衰老組、米糠抗氧化肽各組小鼠均存在3867bp片段不同程度缺失現(xiàn)象，高劑量組個(gè)別未見(jiàn)缺失；衰老組缺失型與野生型mtDNA的光密度比值較對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)；而與衰老組相比，米糠抗氧化肽各組該比值則有不同程度降低，中、高劑量組降低呈極顯著水平(P＜0.01)，但中、低劑量組較對(duì)照組仍有明顯差異(P＜0.01)。說(shuō)明米糠抗氧化肽能夠抑制致衰老小鼠腦mtDNA的缺失突變，并呈一定的量效關(guān)系。

3 討 論

目前認(rèn)為，衰老的發(fā)生和發(fā)展與自由基損傷和線粒體缺失突變有直接關(guān)系[9-10]。線粒體是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換和釋放的重要場(chǎng)所，同時(shí)是機(jī)體活性氧、自由基的主要產(chǎn)地。mtDNA位于線粒體內(nèi)膜附近，無(wú)組蛋白保護(hù)，裸露于呼吸鏈產(chǎn)生的大量自由基環(huán)境中，而且其沒(méi)有內(nèi)含子，任何突變都能影響DNA的編碼序列，又缺乏完善的修復(fù)機(jī)制，所以與核DNA相比，mtDNA更易遭受氧化損傷和誘變?cè)吹墓鬧11-13]。mtDNA與體內(nèi)能量代謝直接相關(guān)，參與編碼氧化呼吸鏈組成成分的多個(gè)蛋白質(zhì)亞單位，因此mtDNA氧化損傷引起mtDNA突變的積累可導(dǎo)致能量產(chǎn)出缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡[14-15]，其中，心、腦等以ATP為主要能源的代謝旺盛器官首先表現(xiàn)衰老[16]；同時(shí)，mtDNA突變與體質(zhì)量減輕、皮下脂肪減少及脊柱彎曲等衰老表現(xiàn)之間亦存在因果關(guān)系[17]。因而延緩線粒體的破壞過(guò)程，可能延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，進(jìn)而延長(zhǎng)機(jī)體的壽命[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)皮下注射D-gal 6周后，與對(duì)照組相比，衰老組小鼠心、腦線粒體CAT、GSHPx、SDH、T-ATPase活性顯著下降，腦mtDNA缺失明顯增加，同時(shí)出現(xiàn)了一系列衰老體征變化，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)衰老模型的建立是成功的。而米糠抗氧化肽各組小鼠CAT、GSH-Px、SDH、T-ATPase活性及mtDNA缺失狀況有不同程度改善，高劑量效果最佳。說(shuō)明米糠抗氧化肽可通過(guò)減輕線粒體氧化損傷，保護(hù)其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)而起到延緩衰老的作用。推測(cè)其機(jī)制可能為：

第一，抗氧化機(jī)制是其發(fā)揮抗衰老作用的前提。米糠抗氧化肽體外測(cè)定表現(xiàn)出的良好的清除O2·和·OH能力[1]，為其在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化活性奠定基礎(chǔ)。通過(guò)直接清除自由基，抑制自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以及提高抗氧化酶活性等，減少了線粒體內(nèi)自由基含量，進(jìn)而保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整：1)減輕了自由基對(duì)膜的攻擊，降低膜脂過(guò)氧化程度，保護(hù)脂質(zhì)體系、膜質(zhì)完整性；2)減輕了自由基對(duì)mtDNA的攻擊，降低mtDNA氧化損傷程度，抑制mtDNA缺失突變，減少有缺陷的呼吸鏈，維持細(xì)胞的能量穩(wěn)定，從而起到抗衰老作用。

第二，從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值角度講，發(fā)揮主要功能的米糠抗氧化肽由16種氨基酸組成，含有9種人體必需氨基酸，占該肽總氨基酸含量的40.28%；其 F值(Fischer Ratio)為4.33，高于人體正常值，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的保健功能[4]；同時(shí)小肽能被腸道直接吸收，而且吸收速度快，可改善腸道功能。由此推測(cè)米糠抗氧化肽可能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)保健功能提高了衰老小鼠抗老防衰的能力。

第三，米糠抗氧化肽是由游離氨基酸、肽段和蛋白質(zhì)共同組成的混合物，其成分可能對(duì)小鼠體內(nèi)一些重要酶，如抗氧化酶、呼吸鏈復(fù)合體酶等的合成代謝或正常功能發(fā)揮具有積極作用，進(jìn)而提高抗衰老能力。

第四，米糠抗氧化肽可能具有一定調(diào)節(jié)糖代謝的能力。

參考文獻(xiàn)：

[1]樊金娟, 付巖松, 羅霞, 等. 米糠肽的抗氧化作用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(12): 78-81.

[2]YOSHIYUKI S, KEIKO W. Structure and activity of angiotensinⅠcoverting enzyme inhibitory peptides from sake and sake lees[J]. Biosci Biotech Biochem, 1994, 58(10): 1767-1771.

[3]TAKAHASHI M, YOSHIKAWA M. Isolation and characterization of oryzatensin: a novel bioactive peptide with ileum-contracting and immunomdulating activities derived from rice albumin[J]. Biochem and Molecular Biol International, 1994, 33(6): 1151-1158.

[4]樊金娟, 羅霞, 董智. 米糠抗氧化肽的提取和純化工藝研究[J]. 食品科技, 2008, 33(12): 169-173.

[5]項(xiàng)平, 高國(guó)全, 姚志彬. 大鼠腦線粒體DNA提取方法[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2000, 6(2): 184-185.

[6]BROSSAS J Y, BAAREAU E, COURTORIS Y, et al. Multipledeletionsin-mitochondrial DNA are present in senescent mouse brain[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 202(2): 654-659.

[7]曾昭惠, 于宏升, 張宗玉, 等. 小鼠衰老與腦缺血時(shí)腦細(xì)胞線粒體DNA片段的缺失[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 1998, 17(3): 136-138.

[8]梁海凌. 康欣口服液對(duì)老年小鼠腦線粒體DNA缺失突變影響的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 福州: 福建中醫(yī)學(xué)院, 2006.

[9]BARJA G. Free radicals and aging[J]. Trends Neurosci, 2004, 27(10): 595-600.

[10]SASTRE J, PALLARDO F V, VINA J. The role of mitochondrial oxidative stress in aging[J]. Free Radic Biol Med, 2003, 35(1): 1-8.

[11]遆冬冬, 張咸寧, 祁鳴. 人線粒體DNA與衰老和退行性疾病的研究進(jìn)展[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2007, 36(1): 93-97.

[12]WALLACE D C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging and cancer: A dawn for evolutionary medicine[J]. Annu Rev Genet, 2005, 39: 259-407.

[13]BALABAN R S, NEMOTO S, FINKEL T. Mitochondria, oxidants, and aging[J]. Cell, 2005, 120(4): 483-495.

[14]SOHAL R S, WEINDRUCH R. Oxidative stress, caloric restriction, and aging[J]. Science, 1996, 273(5271): 59-63.

[15]OZAWA T. Mechanism of somatic mitochondrial DNA mutations associated with aging and diseases[J]. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271 (1): 177-189.

[16]張洪泉, 余文新. 中華抗衰老醫(yī)藥學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2000: 95-99.

[17]TRIFUNOVIC A, WREDENBERG A, FALKENBERG M, et al. Premature aging in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase [J]. Nature, 2004, 429(6990): 417-423.

[18]龔開(kāi)政, 張振剛, 黃軼峰, 等. 線粒體ATP敏感鉀通道介導(dǎo)缺氧預(yù)處理期細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶活化的機(jī)制[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 23(9): 644-647.

Anti-aging Effect of Antioxidant Peptides from Rice Bran

FAN Jin-juan1，F(xiàn)U Yan-song1，ZONG Li-li3， ZHANG Xin-yu2，LUO Xia1，ZHU Yan-shu1
(1. College of Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. Institute of Geographical Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China；3. College of Agricultural, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The D-galactose (D-gal)-induced aging model mice were used to explore the effects of antioxidant peptides from rice bran on the activities of catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), succinate dehydrogenase (SDH) and total adenosine triphosphatase (T-ATPase) in mitochondria of heart and brain and on deletion mutation of mitochondria DNA (mtDNA) in brain by polymerase chain reaction (PCR) and photodensity scan. Results indicated that rice bran antioxidant peptides at the condition of high dosage could significantly increase the activities of CAT, GSH-Px, SDH and T-ATPase in mitochondria of heart and brain (P ＜ 0.05); and significantly decrease the depletion of mtDNA in brain (P ＜ 0.01) of D-gal-induced-aging mice when compared with the model group. These investigations suggest that rice bran antioxidant peptides are able to enhance antioxidant function of aging mice induced by D-gal, and have good protective effect on mtDNA.

rice bran antioxidant peptides；mitochondrial DNA (mtDNA)；anti-aging

TS210.1

A

1002-6630(2010)23-0040-04

2010-03-27

遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2008S207)

樊金娟(1972—)，女，副教授，博士，研究方向植物資源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：jinjuanf@hotmail.com