張文芹，許文清，孫 怡，葉 紅，曾曉雄*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

苦丁茶冬青與大葉冬青苦丁茶提取物體外抗氧化活性比較研究

張文芹，許文清，孫 怡，葉 紅，曾曉雄*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

比較苦丁茶冬青苦丁茶和大葉冬青苦丁茶提取液中多酚、黃酮的含量及體外抗氧化能力，結(jié)果表明：多酚含量高的苦丁茶冬青苦丁茶比黃酮含量高的大葉冬青苦丁茶具有較高的體外抗氧化能力；對(duì)5種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，表明各抗氧化方法間相關(guān)性良好(R2＞0.8478)，尤以DPPH自由基法與ABTS＋·法的相關(guān)性最高(R2=0.9967)。

苦丁茶冬青苦丁茶；大葉冬青苦丁茶；多酚；黃酮；抗氧化

苦丁茶是我國(guó)南部和東部地區(qū)人民飲用的一種代用茶，富含多酚、黃酮、皂素、氨基酸等多種活性物質(zhì)，具有散風(fēng)熱、清頭目、生津止渴、消食提神、消炎、殺菌、止癢、減肥、降血壓等多種藥理功能[1-4]。有關(guān)苦丁茶的原植物一直存在爭(zhēng)議，現(xiàn)已報(bào)道有31種植物在不同地區(qū)被稱為苦丁茶[5]，其中最主要的3種為冬青科的苦丁茶冬青(Ilex kudingeha CJ Tseng)、大葉冬青(Ilex latifolia Thunb)和枸骨(Ilex cornuta Lindl. Ex Paxt.)[6-7]，并主產(chǎn)于海南、廣東、廣西、湖南、浙江等省。

多酚類化合物是高等植物中普遍存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性。但是，有關(guān)苦丁茶多酚含量以及抗氧化活性的研究較少[8]。實(shí)驗(yàn)以苦丁茶冬青樹葉加工而成的苦丁茶為原料，采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定苦丁茶粗提物和各萃取物的多酚含量，并應(yīng)用DPPH自由基法、TEAC法和FRAP法測(cè)定粗提物和各萃取物的抗氧化活性，結(jié)果表明苦丁茶提取物具有較高的多酚含量和較強(qiáng)的抗氧化能力。在此基礎(chǔ)上，擬通過測(cè)定大葉冬青苦丁茶與苦丁茶冬青苦丁茶的多酚與黃酮含量、自由基清除能力(包括清除D P P H自由基、ABTS+·和·OH)及還原Fe3+為Fe2+的能力，比較兩種苦丁茶的抗氧化活性，旨在為苦丁茶的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦丁冬青苦丁茶(海南) 海南椰仙生物科技有限公司；

大葉冬青苦丁茶(浙江) 浙江大學(xué)茶業(yè)科技開發(fā)公司。

Folin-Ciocalteu試劑、綠原酸(CHA)、DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 和ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenothiazolin-6-sulfonate) 美國(guó)Sigma公司；TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-trizaine) Fluka公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-88型往復(fù)水浴恒溫振蕩器、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國(guó)華電器有限公司；冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；722S可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；BL-220H分析天平 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶粗提物的制備

準(zhǔn)確稱取粉碎過篩的苦丁茶樣，用沸水以料液1:10 (m/V)比于95℃水浴中提取30min，5000×g離心10min，取上清液，剩余殘?jiān)貜?fù)以上操作，合并上清液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得苦丁茶粗提物。稱取一定量粗提物，用水溶解，即為分析用樣品液。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定

多酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法[9]。取0.5mL樣品液(適當(dāng)稀釋)與1.0mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，靜置5min，加入2.0mL飽和Na2CO3溶液，30℃水浴反應(yīng)1h，冷卻，測(cè)定747nm波長(zhǎng)處吸光度。樣品中多酚含量以CHA(綠原酸)當(dāng)量表示。

1.3.3 黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定采用AlCl3法[10]。稱取5mg蘆丁加入10mL 30%乙醇，配成0.5mg/mL的母液，依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.08、0.05、0.04、0.02mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液, 測(cè)定430nm波長(zhǎng)處吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1.0mL樣品液(適當(dāng)稀釋)與1mL 30g/100mL AlCl3乙醇溶液混勻，室溫反應(yīng)10min，測(cè)定430nm波長(zhǎng)處吸光度。樣品中黃酮含量以蘆丁的當(dāng)量表示。

1.3.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

1.3.4.1 ABTS+·清除能力的測(cè)定

參照Stratil等[11]的方法(TEAC法)。取3.9mL ABTS+·溶液與0.1mL樣品液混合、搖勻，37℃水浴反應(yīng)并計(jì)時(shí)，以磷酸鹽緩沖液調(diào)零，測(cè)定反應(yīng)液在第10min時(shí)734nm波長(zhǎng)處的吸光度(Ai)，同時(shí)測(cè)定3.9mL ABTS+·溶液與0.1mL的磷酸鹽緩沖液的吸光度(Ac)和3.9mL的磷酸鹽緩沖液與0.1 mL的樣品液的吸光度(Aj)。樣品對(duì)ABTS+·的清除率按照式(1)計(jì)算。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Leong等[12]的方法。將DPPH自由基的無水乙醇溶液3mL1×10-4mol/L與0.1mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液混合，搖勻，室溫、暗室反應(yīng)30min。以無水乙醇調(diào)零，測(cè)517nm波長(zhǎng)處吸光度(A1)，同時(shí)測(cè)定0.1mL樣液與3.0mL無水乙醇混合液的吸光度(A2)和0.1mL無水乙醇與3.0mL DPPH自由基醇溶液混合液的吸光度(A0)。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率按照式(2)計(jì)算。

1.3.4.3 ·OH清除能力的測(cè)定

參照曾曉玲[13]、金鳴等[14]的方法。依次加入2.0mL 0.15mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)、1.0mL 7.5×10mol/L鄰二氮菲、1.0mL 7.5×10mol/L FeSO4、1.0mL樣品液，立即混勻后，加入1.0mL 0.01% H2O2，混勻，37℃水浴反應(yīng)60min，測(cè)定536nm波長(zhǎng)處的吸光度(A樣)。以1.0mL的蒸餾水代替樣品液，迅速混勻后加入1.0mL 0.01% H2O2，待反應(yīng)結(jié)束測(cè)其吸光度(A損)。以2.0mL的蒸餾水代替樣品液與0.01% H2O2，迅速混勻，待反應(yīng)結(jié)束測(cè)其吸光度(A未損)。樣品對(duì)·OH清除能力按照式(3)計(jì)算。

1.3.4.4 還原能力的測(cè)定

方法1：參照Benzie等[15]的方法(FRAP法)。取0.2mL樣品溶液加入3.0mL FRAP試劑(由300mmol/L醋酸鹽緩沖液300mL、10 mmol/L TPTZ溶液30mL、20mmol/L FeCl3·6H2O溶液30mL組成)，混勻后37℃反應(yīng)10min，測(cè)定593nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，以1mmol/L FeSO4為對(duì)照。樣品抗氧化能力(FRAP值)以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

方法2：參考Oyaizu[16]的方法。取0.4mL樣品液(適當(dāng)稀釋)，加入0.4mL 0.2mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.6) 及0.4mL 1g/100mL K3Fe(CN)6，混合均勻，于50℃下反應(yīng)20min ，再加入0.4mL 的10 g/100mL三氯乙酸，混合后5000×g離心10min。取上清液1.0mL，加入1.0mL蒸餾水和0.2mL 0.1g/100mL的三氯化鐵溶液，混合均勻，室溫下反應(yīng)10min，測(cè)定其700nm波長(zhǎng)處的吸光度。實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉冬青苦丁茶與苦丁茶冬青苦丁茶的多酚與黃酮含量

苦丁茶冬青苦丁茶、大葉冬青苦丁茶提取液的多酚含量分別為131.91、120.93mg綠原酸/g(以干質(zhì)量計(jì))，

黃酮含量分別為13.91、16.74mg蘆丁/g(以干質(zhì)量計(jì))?？喽〔瓒嗫喽〔枧c大葉冬青苦丁茶多酚及黃酮含量有明顯的差別，苦丁茶冬青苦丁茶多酚含量高于大葉冬青苦丁茶，而黃酮含量卻低于大葉冬青苦丁茶。

2.2 大葉冬青苦丁茶與苦丁茶冬青苦丁茶的抗氧化能力分析

圖1 大葉冬青苦丁茶與苦丁冬青苦丁茶的清除自由基能力的比較Fig.1 Comparisons of scavenging activities of kudingchas made from Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J. Tseng

2.2.1 ABTS+·的清除能力

TEAC法常被用于總抗氧化能力的測(cè)定[17-18]。利用該法測(cè)定大葉冬青苦丁茶與苦丁茶冬青苦丁茶提取液的抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青苦丁茶提取液的清除能力比大葉冬青苦丁茶提取液的稍強(qiáng)(圖1A)，苦丁茶冬青苦丁茶提取液的IC50(清除率達(dá)50%時(shí)所需要的濃度)為124.3μg/mL，大葉冬青苦丁茶提取液的IC50為133.1μg/mL (表1)。IC50越低，樣品的抗氧化能力越強(qiáng)，這也說明苦丁茶冬青苦丁茶提取液的清除能力比大葉冬青苦丁茶提取液的稍強(qiáng)。

2.2.2 DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種合成的有機(jī)自由基，常用來研究酚類抗氧化劑的構(gòu)效關(guān)系，是近年來受到國(guó)內(nèi)外普遍重視的一種分析抗氧化活性的方法[19-21]。由圖1B可知，苦丁茶冬青苦丁茶對(duì)DPPH自由基的清除率高于大葉冬青苦丁茶。提取液的IC50值見表1，苦丁冬青苦丁茶提取液的IC50為234.6μg/mL，大葉冬青苦丁茶提取液的IC50為262.1μg/mL。

2.2.3 ·OH的清除能力

·OH被公認(rèn)是生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧，能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷。兩種苦丁茶提取液的IC50見表1，苦丁茶冬青苦丁茶提取液的IC50為32.8μg/mL，大葉冬青苦丁茶提取液的IC50為56.1μg/mL。由圖1C可知，苦丁茶冬青苦丁茶對(duì)·OH的清除能力高于大葉冬青苦丁茶。

2.2.4 還原能力

FRAP法的原理是基于具有抗氧化活性的物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+的能力，因Fe2+與TPTZ反應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并在593nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰[23]，通過吸光度的大小判斷待測(cè)物抗氧化能力的強(qiáng)弱。研究結(jié)果表明苦丁茶冬青苦丁茶提取液與大葉冬青苦丁茶提取液的FRAP值分別為4.95、4.88mmol FeSO4/g(以干質(zhì)量計(jì))，兩者沒有明顯差異(表1)。

表1 苦丁茶粗提物的抗氧化能力測(cè)定結(jié)果Table 1 Antioxidant activities of crude extract of kudingcha

此外本研究還利用Fe3+-Fe2+氧化還原體系測(cè)定苦丁茶粗提取物的還原能力，該方法可以評(píng)估試樣是否為良好的電子供體[24]。Fe3+被抗氧化物質(zhì)還原成為Fe2+，吸光度越大，表明還原能力越強(qiáng)。結(jié)果如表1所示，苦丁茶冬青苦丁茶的還原能力為207.2mgVC/g，而大葉冬青苦丁茶的為162.9mgVC/g。由此可見苦丁茶冬青苦丁茶還原力大于大葉冬青苦丁茶，表明苦丁茶冬青苦丁茶具有更好的抗氧化能力。

通過應(yīng)用5種方法綜合測(cè)定大葉冬青苦丁茶及苦丁茶冬青苦丁茶的體外抗氧化能力，結(jié)果表明(表1)，苦丁茶冬青苦丁茶體外抗氧化能力各指標(biāo)均高于大葉冬青苦丁茶，說明苦丁茶冬青苦丁茶既有較高的自由基清除能力又有較強(qiáng)的還原Fe3+成為Fe2+能力。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 多酚和黃酮含量與各抗氧化方法的相關(guān)性分析

表2 相關(guān)性分析Table 2 Analysis of correlation coefficients

通過對(duì)多酚含量和黃酮含量與各抗氧化性評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性分析可以得出多酚與各方法的相關(guān)性較黃酮高(表2)。由此推測(cè)多酚可能是苦丁茶中主要的抗氧化成分，抗氧化能力與多酚含量具有相同的趨勢(shì)，這與之前的報(bào)道結(jié)果一致[8,25]。通過比較各相關(guān)性因子可以看出苦丁茶冬青苦丁茶中多酚含量與D P P H自由基、ABTS+·以及·OH清除能力的相關(guān)性明顯高于大葉冬青苦丁茶，而鐵離子還原抗氧化劑能力與總還原力則是與大葉冬青苦丁茶中多酚含量的相關(guān)性較高。DPPH自由基清除能力、鐵離子還原抗氧化劑能力以及總還原力與大葉冬青苦丁茶中黃酮含量的相關(guān)性比苦丁茶冬青苦丁茶高，而ABTS+·、·OH清除能力與大葉冬青苦丁茶黃酮含量的相關(guān)性比苦丁茶冬青苦丁茶低。

2.3.2 抗氧化評(píng)價(jià)方法之間相關(guān)性分析

通過對(duì)各抗氧化評(píng)價(jià)方法進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析可以得出各種評(píng)價(jià)方法在本實(shí)驗(yàn)中相關(guān)性均較好(R2＞0.8478)。由表2可以看出，苦丁茶冬青苦丁茶中相關(guān)性最高的兩種方法為FRAP法與DPPH自由基法，相關(guān)性因子R2為0.9780；相關(guān)性最低的兩種方法為總還原力測(cè)定法與·OH清除能力測(cè)定法，相關(guān)因子R2為0.8832。大葉冬青苦丁茶中相關(guān)性最高的兩種方法為TEAC法與DPPH法，相關(guān)性因子R2為0.9967；相關(guān)性最低的兩種方法為總還原力測(cè)定法與·OH清除能力測(cè)定法，相關(guān)因子R2為0.8478。因此，無論是苦丁茶冬青苦丁茶還是大葉冬青苦丁茶，相關(guān)性最低的兩種方法均是總還原力測(cè)定與·OH清除能力測(cè)定法，這可能與兩種方法的測(cè)定原理有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗氧化活性較高的樣品同時(shí)含有較高的多酚含量，由此可以初步判定多酚為苦丁茶提取液抗氧化能力的主要物質(zhì)來源。而且綜合各種抗氧化方法及相關(guān)性可以看出，苦丁茶冬青苦丁茶的抗氧化性比大葉冬青苦丁茶的抗氧化性強(qiáng)，這可能與苦丁茶冬青苦丁茶中多酚含量高相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于苦丁茶水提取液的抗氧化能力評(píng)價(jià)采用了兩套不同的評(píng)價(jià)體系。評(píng)價(jià)體系之一為評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基的清除能力，在這一評(píng)價(jià)體系中選用了對(duì)DPPH自由基、ABTS+·及·OH的清除能力作為評(píng)價(jià)方法。評(píng)價(jià)體系之二為評(píng)價(jià)樣品的還原能力，采用測(cè)定鐵離子還原抗氧化劑的能力、總還原力兩種不同的測(cè)定方法。之所以選用兩種不同的評(píng)價(jià)體系是因?yàn)檫@兩套不同的體系可以共同并較為準(zhǔn)確的反映樣品的抗氧化能力。在不同的體系內(nèi)部選用不同的方法主要是為了彌補(bǔ)單種獨(dú)立評(píng)價(jià)方法的不足，以防方法的局限性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的片面性。由分析結(jié)果來看體系內(nèi)部各方法之間相關(guān)性非常顯著，而自由基清除能力評(píng)價(jià)體系與還原能力評(píng)價(jià)體系兩體系之間相關(guān)性相對(duì)較低。研究結(jié)果充分說明了選取不同體系對(duì)樣品抗氧化能力同時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)的必要性。

3 結(jié) 論

本研究比較苦丁茶冬青苦丁茶和大葉冬青苦丁茶提取液中多酚、黃酮的含量及體外抗氧化能力，結(jié)果表明兩種苦丁茶均具有較好的體外抗氧化活性；相對(duì)而言，多酚含量高的苦丁茶冬青苦丁茶比黃酮含量高的大葉冬青苦丁茶具有較高的體外抗氧化能力。因此，富含多酚類物質(zhì)和良好抗氧化活性的苦丁茶冬青苦丁茶和大葉冬青苦丁茶具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Comparative Evaluation of Antioxidant Activity in vitro of Aqueous Extracts from Ilex kudingcha C.J. Tseng and Ilex latifolia Thunb Leaf Teas

ZHANG Wen-qin，XU Wen-qing，SUN Yi，YE Hong，ZENG Xiao-xiong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The contents of polyphenols and flavonoids and the antioxidant activities in vitro of aqueous extracts from the leaf teas of Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J. Tseng were determined. It was found that the aqueous extract from Ilex kudingcha C.J. Tseng had both higher polyphenol content and in vitro antixodiant performance than that from Ilex latifolia Thunb. The correlation analysis among five antioxidant evaluation methods in vitro demonstrated that there was a good correlation among them (R2＞0.8478), and the correlation between DPPH and ABTS+free radical scavenging assays was the most significant (R2= 0.9967).

Ilex kudingcha C.J. Tseng leaf tea；Ilex latifolia Thunb leaf tea；polyphenol；flavonoid；antioxidant activit

Q946.84

A

1002-6630(2010)23-0022-05

2010-05-20

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z351)；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才引進(jìn)基金項(xiàng)目(804066)

張文芹(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：Zhangwenqin51@163.com

*通信作者：曾曉雄(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn