曾媛琴 莫琳 朱勇 龔競

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,重慶 400716)

目前,昆蟲對(duì)有毒物質(zhì)產(chǎn)生抗性的研究主要有三個(gè)方面,即:生理抗性、代謝抗性、行為抗性。生理抗性是指表皮穿透率降低,分隔作用,脂肪體等惰性部位貯存有毒物質(zhì)的能力增強(qiáng),排泄作用及靶標(biāo)部位敏感度降低等引起的抗性;代謝抗性是指由于抗性昆蟲利用解毒酶的量或質(zhì)的變化來迅速降解有毒物質(zhì)而引起的抗性[1]。

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AchE,EC3.1.1.7)在神經(jīng)突觸間隙中通過催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)來維持神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞[2-4]。AChE是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的作用靶標(biāo),活性位點(diǎn)絲氨酸被磷酰化和氨基甲?；?神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo)功能被阻斷,因此可以通過測定AChE活力被抑制的程度快速檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量[5]。

AchE對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑的抗性機(jī)制是在ABE結(jié)構(gòu)基因上的多位點(diǎn)突變,形成幾種不敏感的AChE同功酶[6]。昆蟲的AChE的基因突變有可能導(dǎo)致該酶對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑敏感性降低[7-8]。除了酶性質(zhì)發(fā)生改變外,昆蟲也可通過AChE基因表達(dá)量的增加而對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性。在果蠅中,AChE的過量產(chǎn)生導(dǎo)致了對(duì)馬拉硫磷的高度抗性[9]。有機(jī)磷抗性麥二叉蚜AChE活性顯著高于敏感個(gè)體,通過Southern blot和Northern blot分析表明,抗性個(gè)體AChE活性不是由于基因突變造成的,而是由于基因表達(dá)量增加所致[10-11]。

我們在以前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了家蠶耐氟性產(chǎn)生的兩條重要途徑,其中之一位于頭部組織,家蠶乙酰膽堿酯酶主要在頭部組織表達(dá)。我們通過浸葉法添氟檢測氟是否對(duì)家蠶的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 家蠶品種

家蠶耐氟品種秋豐x白玉,敏感品種734,25℃恒溫,75±5%濕度養(yǎng)育,人工光照16h,黑夜8h。每天喂養(yǎng)3次新鮮桑葉。分為清水對(duì)照組秋豐x白玉C(秋*白C)和734C、氟處理組秋豐x白玉F(秋*白F)和734F(4齡起蠶開始飼喂用200ppmNaF浸泡25分鐘后自然晾干的桑葉)。每組各100頭,分為10區(qū),每區(qū)10頭,用于取樣檢測。每天每組隨機(jī)取10只,解剖獲取頭部組織,用生理鹽水和DEPC水沖洗后,液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie brilliant blue G-250)(上?；瘜W(xué)試劑公司);碘化硫代乙酰膽堿(AcetylthioeholineiodideATChI)(上海生工);5,5'-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)(上海生工);

1.2.2 主要儀器

190型酶標(biāo)儀(美國FT公司);冷凍離心機(jī)(湖南湘儀有限公司)。

1.3 酶原蛋白含量的測定

1.3.1 酶液的制備

挑取各組5只幼蟲頭部組織,加入1ml,0.01MpH8.0的PBS(含0.1%T riton),冰浴勻漿。勻漿液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管,4℃15 000rpm離心30min,取上清液備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照Bradford[12]考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行測定。不同含量(0,1,2,3,4,5ug)的牛血清白蛋白、0.05MpH7.5PBS共50ul,與0.01%,200ul考馬斯亮藍(lán)G-250在37℃反應(yīng)10min,595nm條件下測其OD值(表1)。以牛血清白蛋白含量(μ g)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 蛋白質(zhì)含量測定

1.3.3 酶原蛋白含量的測定

參照Bradford考馬斯亮藍(lán)G一250法,按照表1步驟進(jìn)行測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出家蠶頭部組織酶原蛋白質(zhì)含量(μ g pro/insect)。

1.4 AChE活性的測定

1.4.1 酶液制備

酶液制備方法參照1.4.1。

1.4.2 活性測定

參照Ellman[13]方法并加以改進(jìn)。用碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)作底物,經(jīng)AChE水解后生成硫代膽堿和乙酸,與DTNB生成黃色物質(zhì),于37℃反應(yīng)10min,412nm下測定其OD值,掃描20min,每20sec讀一次數(shù),并計(jì)算AChE活力(nmol.min.-1·insect-1)。

2 結(jié)果

2.1 家蠶乙酰膽堿酯酶酶原蛋白的測定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測得標(biāo)準(zhǔn)取錢,得到回歸方程式:y=0.1077x+0.9886(y代表OD值,x代表蛋白質(zhì)含量g),相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和所測酶液的OD值,計(jì)算出家蠶4齡以后每天酶原蛋白含量。結(jié)果顯示,4齡期,除了734F,各組的耐氟品種秋豐x白玉顯示了與敏感品種734的不同。4齡起蠶開始添氟后,734F的酶原蛋白含量4齡1天急劇降低,4齡2天以同樣的速率急劇升高,4齡3天,終于酶原蛋白含量升到1.114ug,比734C增加了0.12%,卻再也無力上升,急劇下降,最終全部死亡(圖1)。秋豐x白玉F從添氟開始,酶原蛋白含量急劇升高到1.13ug,比對(duì)照組增加了2.0%,然后急劇下降,進(jìn)入眠期。5齡起蠶添氟后,酶原蛋白含量升高時(shí)間晚于對(duì)照組一天,增長速率卻大于對(duì)照組,最終酶原蛋白含量始終高于對(duì)照組(圖2)。同時(shí)可以看到,耐氟品種添氟組酶原蛋白含量始終高于敏感品種添氟組。

圖1 4齡對(duì)照組和處理組酶原含量

圖2 秋豐X白玉4～5齡AChE酶原蛋白含量

2.2 家蠶乙酰膽堿酯酶活性檢測

家蠶4齡起蠶添氟,耐氟品種秋豐x白玉與敏感品種734 AchE活性差異顯著。秋豐x白玉F酶活性與對(duì)照組差異不大,734F添氟開始AchE活性就遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組(圖3)。秋豐x白玉F從4齡開始酶活雖然與對(duì)照組相差不大,但一直略小于秋豐x白玉C。耐氟品種秋豐x白玉F酶活性始終高于敏感品種添氟組。

圖3 不同品種家蠶4齡AChE活性

圖4 秋豐x白玉4～5齡AChE活性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了添氟對(duì)家蠶乙酰膽堿酯酶蛋白含量和酶活性的影響。毫無疑問,氟對(duì)家蠶乙酰膽堿酯酶造成了影響。敏感品種的酶原蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組,雖然也曾上升,但最終最多只能比對(duì)照組增加0.12%。而耐氟品種秋豐x白玉F卻能夠比對(duì)照組增加2%,是敏感品種734的16.7倍。而且耐氟品種秋豐x白玉F的酶原蛋白含量幾乎一直高于對(duì)照組。因此我們認(rèn)為,乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)量的增加是家蠶耐氟性的原因之一,而且耐氟性能力的強(qiáng)弱與乙酰膽堿酯酶表達(dá)量增加的多少直接相關(guān)。

我們檢測了4齡開始每天的乙酰膽堿酯酶活性。實(shí)驗(yàn)顯示,氟對(duì)家蠶乙酰膽堿酯酶活性產(chǎn)生了重要影響。添氟品種的乙酰膽堿酯酶活性始終低于對(duì)照組。敏感品種734添氟開始酶活性相差非常大,相差了14%,并且活性始終未能增加到和對(duì)照組持平;耐氟品種秋豐x白玉添氟開始活性卻相差不大,我們估計(jì)與添氟開始酶原蛋白含量的急劇增加相關(guān)。雖然從4齡到5齡,秋豐x白玉F的AChE活性略低于對(duì)照組,但總是有等于對(duì)照組的時(shí)候(4齡2天,4齡4天,5齡3天和5齡5天),我們認(rèn)為這與酶原蛋白始終高于對(duì)照組有關(guān)。

乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)量的增加彌補(bǔ)了乙酰膽堿酯酶活性的受損,使乙酰膽堿酯酶活性總體持平,從而使家蠶產(chǎn)生了耐氟性。我們在以前的氟檢測中發(fā)現(xiàn)了家蠶耐氟品種有兩條重要的耐氟途徑,其中之一就是頭部組織產(chǎn)生的耐氟性。我們認(rèn)為乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)量的增加就是頭部組織耐氟性的重要原因之一。乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)量增加的分子途徑和氟究竟是怎樣導(dǎo)致敏感品種的乙酰膽堿酯酶酶原蛋白含量的降低等值得我們進(jìn)一步的深入研究。

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