劉春 陳玉琳 代方銀 韓宇 魏麗婉 劉品彥 任靜波 夏慶友

(西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所,重慶 400716)

家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲,其最大的經(jīng)濟價值在于其能夠吐絲,而絲腺作為家蠶最大的器官,是唯一能夠分泌絲蛋白的器官,它能高效特異的合成絲蛋白。一頭家蠶擁有兩條左右對稱的絹絲腺,一般經(jīng)過25d左右的生長發(fā)育,在幼蟲期食下鮮桑葉約22g,由其絹絲腺特異合成并分泌0.5～lg的絲蛋白[1]。家蠶絲腺高效特異的合成絲蛋白的機制長期以來是絲腺研究的一個重點和難點。

家蠶絲腺是核內(nèi)復制組織,其內(nèi)的基因組沒有有絲分裂和核分裂,而是進行多次的復制,它的細胞分裂僅限于胚胎階段,在整個幼蟲發(fā)育過程中不再分裂[2]。幼蟲絲腺細胞的數(shù)目,前部絲腺(anterior silkg land,ASG)約300個,中部絲腺(middle silkg land,MSG)約250個,后部絲腺(posterior silkg land,PSG)約525個[3]。在幼蟲發(fā)育階段這些細胞在體積上繼續(xù)增長,盡管細胞或細胞核不再分裂,但DNA在沒有有絲分裂的情況下繼續(xù)復制,因此細胞質(zhì)里充滿了大量的樹突狀的DNA[4,5,6]。絲腺這種特殊的核內(nèi)復制方式是絲蛋白高效合成絲蛋白的細胞生物學基礎。在家蠶遺傳資源庫中,保存有不少繭絲突變品種,這些突變種因絲蛋白合成受阻成為研究絲蛋白合成機制的良好材料。目前研究比較多的絲腺突變品種有:裸蛹Nd、Nd(2)、絲膠繭Nd-s(02-020)和絲膠繭D Nd-sD;Nd的突變位于25連鎖群,它不分泌絲素,繭層僅含絲膠,極薄,多數(shù)不能成繭;Nd-s及Nd-sD乃由定位于14連鎖群由f ib-L突變引起的,它們由于絲素輕鏈不能正常合成,作成只含絲膠的繭,這兩者的繭絲突變形狀很相似[1];對于Nd,前人在研究中發(fā)現(xiàn)蠶體絹絲腺退化,絲素基因轉(zhuǎn)錄量很低,僅是正常大造的十幾分之一,半數(shù)不能正常吐絲結(jié)繭[7]。筆者在本文中對該突變品種絲腺及其絲腺細胞的發(fā)育特點,從形態(tài)學上對其絲腺進行比較觀察,為揭示其突變機理奠定基礎,為闡明絲蛋白合成機制提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

Nd、Nd-s及大造均由西南大學家蠶基因資源庫保存提供。飼養(yǎng)條件:室溫(25℃左右);常規(guī)桑葉育飼養(yǎng)。

1.2 取材方法

以兩根解剖針分別拉扯家蠶頭部和尾部的方式(適于低齡期蠶),或解剖盤內(nèi)以大頭針固定、眼科剪剪開蠶體從而取出絲腺的方式(適于3齡以后蠶),獲得不同品種家蠶不同齡期及眠期的絲腺,經(jīng)甲醇固定,再以熒光燃料DAPI對其細胞核進行染色5～10min,并在顯微鏡(O-lympus BX51)紫外光激發(fā)(Olympus BH2-RFL-T3)下觀察染色結(jié)果,同時拍攝記錄下結(jié)果。

1.3 絲腺的不同區(qū)域的鑒定方法

在紫外光的激發(fā)下,經(jīng)DAPI染色后的絲腺細胞核清晰可見;而由于生理結(jié)構(gòu)上MSG明顯比ASG、PSG的腺腔更寬大,因此,在蟻蠶絲腺細胞核均呈點狀的情況下,通過對腺腔大小的比較,則可明確找到ASG與MSG、MSG與PSG的分界處。

1.4 統(tǒng)計分析

求平均值:去掉該組數(shù)據(jù)中的極大/極小值,再求和除以個數(shù);方差分析參考文獻8.

1.5 f ib-H末端序列測序

提取Nd及大造PSG的RNA合成cDNA(Takara),其方法按試劑說明書進行。根據(jù)f ib-H基因的末端序列設計引物:F:5'-GGAACAGGCTCTTCTGGATT TG-3';R:5'-GCGGACGT TACGACGAGAA-3'。利用合成的cDNA作為模板進行RT-PCR獲得目的片段;膠回收試劑盒回收PCR擴增的目的片段,然后與pMD19-T simple載體連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆進行培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA提取及測序反應(上海生工)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三品種家蠶MSG、PSG細胞數(shù)量考察

家蠶絲腺起源于外胚層的器官,細胞的分裂僅在胚胎期經(jīng)10次分裂而完成;絲腺母細胞是二倍體(2n),含有兩份基因組DNA[1];在幼蟲期,絲腺細胞不再分裂,隨著蠶體的生長,只有絲腺細胞的肥大生長和細胞核內(nèi)有絲分裂,因此,其細胞數(shù)量是不會發(fā)生變化的[1];在蟻蠶期,家蠶絲腺細胞核呈點狀,形態(tài)清晰,數(shù)量明確,細胞核的個數(shù)即為細胞的數(shù)量;在5齡3天,Nd的后部絲腺與正常相比,極其的短(圖1),但這種短小是否是由于絲腺的細胞數(shù)的減少引起的未知,因此,我們首先對絲腺的細胞數(shù)進行了調(diào)查。通過DAPI對每個品種10條蟻蠶的細胞核進行染色觀察后,得到了以下統(tǒng)計結(jié)果:

表1 蟻蠶細胞數(shù)目平均值統(tǒng)計表

由表1可見,大造、Nd-s、Nd三品種的MSG細胞數(shù)均是200個左右,PSG細胞數(shù)約400個左右;即三者的MSG與PSG總數(shù)都在620個左右,較小的差別也是由于品種差異產(chǎn)生的。因此,它們絲腺的細胞個數(shù)差異不大,則三品種絲腺在生長發(fā)育中將表現(xiàn)出的差異,與絲腺細胞的數(shù)目關(guān)系不大。

2.2 Nd絲腺及其細胞核發(fā)育的形態(tài)特征

Nd突變品種絲腺表現(xiàn)出的萎縮現(xiàn)象不是由絲腺細胞的多少引起的,那很有可能是后部絲腺細胞的發(fā)育異常而引起的,因此,我們就不同發(fā)育時期的絲腺細胞進行了觀察。根據(jù)對各個齡期和眠期的比較觀察發(fā)現(xiàn),Nd絲腺細胞的發(fā)育與兩種對照相比,從1～4齡期,3者的絲腺基本沒有什么差異,絲腺細胞核都增大,從3齡開始,絲腺細胞核開始發(fā)生擴散復制,呈彌散狀,如圖2所示。從5齡起開始,Nd絲腺細胞的大小和形態(tài)與對照相比就有明顯的差異,如圖3所示。兩對照品種Nd-s及大造的后部絲腺的細胞核呈樹突狀彌散態(tài),不僅有縱向的擴展,還有很多橫向的分支,如樹叉一樣的密密地占據(jù)了每個細胞的空間,而Nd絲腺細胞核物質(zhì)如柱狀擴散,主要呈縱向的擴展,沒有樹叉狀的核分裂現(xiàn)象。由于這種核分裂方式的差異,導致Nd的細胞體積明顯的比Nd-s和大造的小(如圖4中虛線框出的即是一單個細胞),從而使他們后部絲腺的整體長度也大大超過了Nd,通過觀察,我們認為Nd的突變基因與細胞核分裂有關(guān)。

圖1 大造、Nd-s、Nd 5齡3天絲腺圖

圖2 2～5齡大造、Nd-s、Nd后部絲腺細胞核DAPI染色圖

圖3 5齡3天大造、Nd-s、N d中部絲腺細胞核DAPI染色圖

圖4 大造、Nd-s、N d 5齡3天PSG細胞核DAPI染色結(jié)果

2.3 f ib-H基因末端序列的比較

由于在前人的研究中,Nakano,Y.等人[9-11]研究發(fā)現(xiàn),Nd(2)PSG的細胞數(shù)量與正常的PSG相同,MSG也是正常的,且按正常水平分泌絲膠,分子水平的證據(jù)表明該突變品種絲腺細胞里有Fib-LmRNA的存在,但在絲腺腔中和形成的絲中卻缺乏Fib-L蛋白,因此認為該突變很有可能是Fib-H蛋白C端發(fā)生突變導致其不能與Fib-L蛋白進行結(jié)合而影響絲蛋白的合成和分泌。根據(jù)本文前面的研究結(jié)果表明,Nd的突變表型與Nd(2)十分相似,因此,我們推測該突變也很有可能與Nd(2)的突變機制相同。為了測定f ib-H基因序列末端二硫鍵是否在Nd發(fā)生突變,我們設計了引物對f ib-H的末端序列進行了序列鑒定,測序結(jié)果表明,Nd C端的位于C端起的第20個氨基酸處的半胱氨酸與大造品種相比并沒有發(fā)生突變,可能由于品種間的差異,大造及Nd的C末端的序列與目前報道的f ib-H基因序列有差異,但在半胱氨酸卻是相同的(圖5)。由此可見,Nd的突變不是發(fā)生在f ib-H基因末端的半胱氨酸位點,而是由其它位點或者其它基因突變造成的。

圖5 各品種fib-H基因測序結(jié)果比對

3 討論

Nd是絹絲腺突變品種,繭絲缺乏絲素蛋白,具有繭絲很薄及半數(shù)裸蛹的現(xiàn)象,是研究家蠶絲腺基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和絲蛋白合成分泌的良好材料。本研究對其絲腺細胞數(shù)目及發(fā)育狀態(tài)進行了初步的觀察和研究,結(jié)果表明,Nd中部及后部絲腺細胞數(shù)目與正常家蠶無明顯差別;五齡期中部絲腺長度與對照無差異,但后部絲腺卻十分短;通過對其幼蟲發(fā)育過程中細胞核的觀察得知,Nd中部絲腺細胞核分裂與對照無差異,但后部絲腺的細胞核不發(fā)生樹叉狀的分裂,其細胞長度比對照小,導致后部絲腺短小;對f ib-H基因的末端測序結(jié)果表明,該突變在f ib-H的C末端的起重要作用的半胱氨酸位點也沒有發(fā)生突變。根據(jù)我們的觀察認為,Nd突變品種絲腺的短小不是因為絲腺數(shù)目的減少而引起的,而是細胞核缺少樹叉狀分裂導致細胞的體積變小。因此,認為該突變基因可能與絲腺細胞核分裂有關(guān)。

在家蠶25號染色體上0.0座位,有幾個等位的裸蛹(Nd)突變品種,其中,Nd(2)是Nd類突變種之一,也是產(chǎn)生一種不含絲素的繭,其PSG在長度上相當短,不發(fā)達,且只能產(chǎn)生很少的絲素,連鎖分析表明該突變與f ib-H基因緊密連鎖,Nakano,Y.等人[9-11]根據(jù)他們的研究結(jié)果認為,Nd(2)很有可能是f ib-H蛋白C端發(fā)生突變導致其不能與Fib-L蛋白進行結(jié)合而影響絲蛋白的合成和分泌。雖然目前我們不知道Nd(2)和Nd是否是相同的突變品種還是等位突變品種,但據(jù)我們的觀察認為,Nd突變品種是由于f ib-H基因突變的可能性比較小,盡管該突變品種也與f ib-H基因緊密連鎖。在正常的絲蛋白中,f ib-H蛋白、Fib-L蛋白及P25蛋白分別以6∶6∶1的比例形成絲素蛋白小體,該小體的正確形成對絲蛋白的分泌起極其重要的作用[18]。在我們選用的對照品種中,02-020即Nd-s突變種,該突變品種絲素蛋白Fib-L基因發(fā)生突變導致其產(chǎn)生異常的蛋白[17]。正是由于該突變品種絲腺細胞內(nèi)不能形成絲素小體,導致其絲素蛋白的合成和分泌受阻,因而,其繭絲缺乏絲素。從我們的觀察結(jié)果可知,02-020突變品種無論是在絲腺細胞數(shù)、細胞核的分裂情況及絲腺長度,與大造都沒有明顯的差異,Fib-L基因作為絲蛋白的結(jié)構(gòu)基因,它的突變不影響絲腺的正常發(fā)育,只是影響絲蛋白的合成和分泌。由此我們認為,同樣作為絲素主要結(jié)構(gòu)蛋白的f ib-H基因突變會引起絲腺細胞核的發(fā)育異常的可能性很小,因此,我們推測Nd的突變基因不太可能是f ib-H基因,其末端的測序結(jié)果也排除了起關(guān)鍵作用的半胱氨酸位點發(fā)生突變。目前,家蠶基因組精細圖譜已經(jīng)完成,遺傳連鎖圖譜與物理圖譜也一一對應,同時,家蠶全基因組不同組織的基因芯片表達譜也公布于眾。在我們下一步工作計劃中,將根據(jù)這些信息平臺,結(jié)合目前我們對Nd初步的研究結(jié)果,對家蠶25號染色體進行全染色體分析,期望為我們克隆該突變基因找到一些線索。

家蠶絲腺具有重要的經(jīng)濟價值,在20世紀80年代末,家蠶作為生物反應器的重要應用已引起科學工作者的重視,特別是以家蠶絲腺為生物反應器[12]。雖然現(xiàn)今以家蠶絲腺構(gòu)建研究高效率分泌蛋白質(zhì)的生物反應器有著非常大的開發(fā)前景,但仍然面臨著外源蛋白在絲蛋白中的含量比較低,且外源蛋白多以融合蛋白形式表達、分離純化過程有一定的難度的困難。因而,這種缺少絲素的絲對于研究外源蛋白的分離純化過程將有重要的價值。

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