徐漢福 幸俊逸 王職峰 夏慶友

(西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所,生物技術(shù)學(xué)院,重慶 400716)

來源于鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac轉(zhuǎn)座子,以其高效的轉(zhuǎn)座發(fā)生頻率、準(zhǔn)確的插入和切出以及幾乎不受物種局限等優(yōu)點(diǎn),成為包括果蠅、按蚊等昆蟲和小鼠、人等哺乳動(dòng)物在內(nèi)的許多生物種轉(zhuǎn)基因研究常用的轉(zhuǎn)座介導(dǎo)工具。目前,研究人員基于piggy-Bac轉(zhuǎn)座系統(tǒng),已經(jīng)建立了插入誘變、基因和蛋白誘捕、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子誘捕等遺傳分析工具,顯示出其在基因功能研究中的巨大潛力。

就家蠶轉(zhuǎn)基因而言,盡管研究人員曾進(jìn)行了大量探索,但由于過去未找到類似于果蠅P因子的有效介導(dǎo)工具,轉(zhuǎn)基因蠶的研究一直未能取得突破。直至2000年,Tamura等嘗試?yán)胮iggyBac轉(zhuǎn)座子為介導(dǎo),經(jīng)顯微注射家蠶早期胚胎成功獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的轉(zhuǎn)基因蠶[1]。這種方法后幾經(jīng)改進(jìn),已成為獲得轉(zhuǎn)基因蠶最為有效和主要的方法,有關(guān)家蠶轉(zhuǎn)基因的研究也自此進(jìn)入了快速發(fā)展階段。目前,包括本實(shí)驗(yàn)室在內(nèi),國內(nèi)外已有近10家研究機(jī)構(gòu)建立了以piggyBac為介導(dǎo)的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù),并基于此建立了GAL4/UAS[2]、熱激誘導(dǎo)[3,4]、啟動(dòng)子誘捕[5]和增強(qiáng)子誘捕[6]等工具,研究了保幼激素酯酶(J HE)[7]、雙性基因(Bmdsx)[8]、類胡蘿卜素結(jié)合蛋白(CPB)[9]、犬尿氨酸3-單氧酶(KMO)[10]和蛻皮觸發(fā)激素(ET H)[11]等家蠶基因的功能。同時(shí),還開展了家蠶生物反應(yīng)器、繭絲改性和轉(zhuǎn)基因抗病育種等應(yīng)用基礎(chǔ)研究,獲得了一批有用蛋白生產(chǎn)、有色繭和抗核型多角體病毒(BmNPV)的轉(zhuǎn)基因素材。但總的來說,目前的家蠶轉(zhuǎn)基因研究中,對(duì)piggyBac的研究利用仍集中在基因功能解析和生物反應(yīng)器開發(fā)等方面,而對(duì)其本身的一些特性,如piggyBac的基因組整合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)座后的穩(wěn)定性等,尚無系統(tǒng)的研究報(bào)道。因此,本論文將著重通過分析外源piggyBac轉(zhuǎn)座元件在轉(zhuǎn)基因家蠶中的基因組整合位點(diǎn),研究其插入整合特征,以期為更好的利用piggyBac轉(zhuǎn)座子開展家蠶轉(zhuǎn)基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與分析方法

本研究采用的有效樣本數(shù)據(jù)共67個(gè),包括本次實(shí)驗(yàn)獲得的23個(gè)結(jié)果和已發(fā)表的44個(gè)結(jié)果[1,4,7,10,12-16]。外源piggyBac整合位點(diǎn)區(qū)域的內(nèi)含子、外顯子和非翻譯區(qū)等分析基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中預(yù)測(cè)的基因序列及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行逐一比對(duì)確認(rèn);整合位點(diǎn)上下游區(qū)域分析策略如下:以piggyBac特征性識(shí)別位點(diǎn)T TAA為起點(diǎn),提取其上下游各5bp或10Kb的序列,然后采用本地Blast程序分別在NCBI和SilkDB庫中進(jìn)行批量比對(duì),并結(jié)合手工方法加以確認(rèn);染色體定位采用Silkmap(http://silkworm.swu.edu.cn/silksoft/silkmap.html)。

1.2 材料來源與實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)材料來自于本研究組建立的23個(gè)獨(dú)立的家蠶轉(zhuǎn)基因品系。采用如下方法:

基因組DNA提取:參照Tamura等報(bào)道的方法[1],提取G1代轉(zhuǎn)基因蠶(蛹或蛾)基因組DNA,加ddH2O調(diào)整至終濃度100ng/μ L。

基因組DNA酶切與連接環(huán)化:分別取基因組DNA10μ g,加HaeIII內(nèi)切酶2μ L于50μ L體系中酶切過夜,經(jīng)65℃處理15min,用2倍體積無水乙醇于-20℃條件下沉淀20min后采用12000rmp離心15min,去上清沉淀溶于20μ L ddH2O;取上述處理后的酶切產(chǎn)物5μ L,加T4 DNA連接酶1μ L于50μ L體系中連接過夜;連接反應(yīng)結(jié)束后,加2倍體積無水乙醇至連接產(chǎn)物,于-20℃條件下沉淀20min,后采用12000rmp離心15min,去上清沉淀溶于20μ L ddH2O。

Inverse PCR反應(yīng):所用引物由上海生工合成,包括piggyBac左臂引物pBacL_F:5'-ATCAGTGACACT TACCGCATTGACA-3'和pBacL_R:5'-TGACGAGCT TGT TGGTGAGGAT TCT-3',右臂引物pBacR_F:5'-TACGCATGAT TATCTT TAACGTA-3'和pBacR_R:5'-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3'。PCR反應(yīng)體系:基因組DNA酶切環(huán)化產(chǎn)物2μ L,10×PCR緩沖液2.5μ L,2mmol/L dNT P 2μ L,0.2μ mol/L正反向引物各0.3μ L,EX Taq DNA聚合酶0.3μ L,加ddH2O補(bǔ)至終體積25μ L。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,(95℃30 sec,58℃45 sec,72℃1min)×30個(gè)循環(huán),72℃10min,4℃保存。

PCR產(chǎn)物克隆與測(cè)序:采用全式金試劑盒對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化或克隆至pMD19-T simple載體后送公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 piggyBac轉(zhuǎn)座元件在轉(zhuǎn)基因家蠶中的整合位點(diǎn)

對(duì)本次實(shí)驗(yàn)獲得的23個(gè)和已發(fā)表的44個(gè)共計(jì)67個(gè)有效的piggyBac整合位點(diǎn)進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果顯示:上述序列均能在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到匹配序列,但僅有50個(gè)位點(diǎn)序列(編號(hào)為IS-1～I(xiàn)S-50)能確定其在基因組中的具體位置,其中的46個(gè)可定位至家蠶的18條染色體,但在染色體上的分布并無規(guī)律(圖1)。另外的27個(gè)位點(diǎn)序列因檢索到的匹配序列過多,尚難確定其具體位置。

圖1 外源piggyBac轉(zhuǎn)座元件家蠶染色體上的定位

2.2 piggyBac轉(zhuǎn)座元件在基因內(nèi)部區(qū)域的分布概況

基于IS-1～I(xiàn)S-50位點(diǎn)數(shù)據(jù),采用Blast等程序分析piggyBac轉(zhuǎn)座元件在基因內(nèi)部區(qū)域的插入整合特征,結(jié)果顯示:有6個(gè)整合位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域(占12%),10個(gè)位于5'端調(diào)控區(qū)域(占20%),6個(gè)位于3'端調(diào)控區(qū)域(占12%),而在外顯子區(qū)域沒有檢測(cè)到piggyBac的插入(圖2);另外的28個(gè)整合位點(diǎn)位于基因間區(qū)。該結(jié)果初步說明,在家蠶中,外源piggyBac轉(zhuǎn)座能夠較容易的整合至家蠶基因的內(nèi)部區(qū)域。至于在外顯子中無piggyBac的插入,推測(cè)其中既有可供分析的樣本量還不夠豐富的原因;另一方面,由于外源轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入可能會(huì)對(duì)宿主造成潛在的有害影響,如插入突變干擾基因功能或調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄/翻譯造成宿主能量消耗、異位重組導(dǎo)致基因突變等,故宿主往往啟用自身防御機(jī)制以防止因外源轉(zhuǎn)座子的突然插入而導(dǎo)致基因功能異?；蛉笔У葷撛陲L(fēng)險(xiǎn)。

圖2 外源piggyBac轉(zhuǎn)座元件家蠶基因內(nèi)部區(qū)域的分布

2.3 piggyBac轉(zhuǎn)座元件整合位點(diǎn)兩側(cè)區(qū)域的序列特征

提取67個(gè)樣本中外源piggyBac的特征性識(shí)別位點(diǎn)TTAA兩側(cè)各5bp的序列,分析其堿基組成,結(jié)果顯示:在T TAA兩側(cè)各5bp區(qū)域內(nèi),AT堿基明顯多于GC堿基;其中63個(gè)整合位點(diǎn)兩側(cè)含有T或A堿基,17個(gè)整合位點(diǎn)位于TA之間,21個(gè)整合位點(diǎn)位于TA一側(cè)(圖3)。

以TTAA為起點(diǎn),提取IS-1～I(xiàn)S-50整合位點(diǎn)兩側(cè)各10Kb的基因組序列進(jìn)行分析,結(jié)果如表1所示:在piggyBac整合位點(diǎn)上游基因組序列中,20條序列被注釋為轉(zhuǎn)座酶或反轉(zhuǎn)錄酶,8條序列被注釋為核酸內(nèi)切酶和類反轉(zhuǎn)錄酶蛋白,7條序列為功能未知基因和其它基因(與C-type lectin、fez1和innexin 2等具有相似性),15條序列未檢索到注釋結(jié)果。整合位點(diǎn)下游基因組序列注釋結(jié)果與上游序列類似,22條序列被注釋為轉(zhuǎn)座酶或反轉(zhuǎn)錄酶,4條序列被注釋為核酸內(nèi)切酶和類反轉(zhuǎn)錄酶蛋白,9條序列為功能未知基因和其它基因(與FGFR1 oncogene partner 2、fez1和membrane protein TMS1等具有相似性),15條序列未檢索到注釋結(jié)果。據(jù)此可以推測(cè),盡管piggyBac轉(zhuǎn)座子是以隨機(jī)方式插入到宿主基因組,但其在插入位點(diǎn)的選擇上更傾向于轉(zhuǎn)座子/反轉(zhuǎn)座子聚集的熱點(diǎn)區(qū)域(hot spot regions),這可能是包括piggy-Bac在內(nèi)的某些轉(zhuǎn)座子的共同特征,同時(shí)也可能是宿主對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行廣泛防衛(wèi)以減少其對(duì)自身危害的結(jié)果。

圖3 piggyBac靶位點(diǎn)序列T TAA兩側(cè)各5個(gè)堿基位置的堿基組成

表1 piggyBac整合位點(diǎn)兩側(cè)各10Kb序列的基因注釋結(jié)果

3 討論

自1998年piggyBac轉(zhuǎn)座子首次被用于果蠅轉(zhuǎn)基因[17]并獲成功以來,國內(nèi)外對(duì)該轉(zhuǎn)座子的研究主要集中在利用其獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體從而進(jìn)行基因功能解析等方面,在家蠶中還被應(yīng)用于遺傳素材創(chuàng)新和生物反應(yīng)器研究。但總的來說,目前對(duì)piggyBac在轉(zhuǎn)基因生物體基因組中的插入與整合位點(diǎn)特征、遺傳與表達(dá)穩(wěn)定性等具體信息還知之甚少,而這又是開展轉(zhuǎn)基因研究所不能回避的重要內(nèi)容。最近,研究人員開始關(guān)注并研究了轉(zhuǎn)基因小鼠[18,19]、人源T細(xì)胞[20]、瘧原蟲[21]等基因組中外源piggyBac的整合位點(diǎn)特征,獲得的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)為利用其開發(fā)插入誘變等高效遺傳分析工具提供了重要參考。但在家蠶中,外源piggyBac的整合位點(diǎn)有何規(guī)律或獨(dú)特特征?這是開展家蠶轉(zhuǎn)基因研究必須回答的問題之一。

本研究初步證實(shí),外源piggyBac在家蠶基因組中的整合位點(diǎn)呈以下特點(diǎn):1)在染色體上的分布廣泛且無規(guī)律,這與piggyBac以隨機(jī)方式插入整合的特征一致。但從其特征性位點(diǎn)T TAA兩側(cè)的堿基組成來看,piggyBac更傾向于插入到富含A、T、AT或TA堿基的區(qū)域,這可能有利于轉(zhuǎn)座酶識(shí)別基因組中的T TAA位點(diǎn)并催化piggyBac發(fā)生轉(zhuǎn)座;2)在整合位點(diǎn)兩側(cè)各10Kb的區(qū)域范圍內(nèi),注釋基因多為轉(zhuǎn)座酶、反轉(zhuǎn)錄酶或類反轉(zhuǎn)錄酶蛋白等,推測(cè)其可能為piggyBac插入整合的熱點(diǎn)區(qū)域(hot spot regions)。這一特點(diǎn)類似于大多數(shù)其它類型的轉(zhuǎn)座子,亦可能有利于piggyBac的轉(zhuǎn)座插入;3)piggyBac能夠插入到基因內(nèi)部區(qū)域。盡管本研究中暫未檢測(cè)到插入基因外顯子區(qū)域的例子,但至少可以證實(shí),外源piggyBac能較容易的在家蠶基因內(nèi)部發(fā)生轉(zhuǎn)座整合,提示利用其開發(fā)插入誘變、基因誘捕、增強(qiáng)子或啟動(dòng)子誘捕等家蠶功能研究工具是可行的。

盡管利用piggyBac轉(zhuǎn)座子開展家蠶轉(zhuǎn)基因研究不過10年,但已經(jīng)取得了令人振奮的長足進(jìn)步。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶中piggyBac的整合位點(diǎn)等特征進(jìn)行研究,將有助于我們進(jìn)一步了解并挖掘其利用潛力,為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究家蠶基因功能、創(chuàng)建新型素材和蠶品種以及開發(fā)家蠶生物工廠等提供基礎(chǔ)參考。

[1]Tamura T,Thibert C,Royer C,Kanda T,Abraham E,Kamba M,Komoto N,Thomas JL,Mauchamp B,Chavancy G,Shirk P,Fraser M,Prudhomme JC,Couble P.Germline transformation of the silkworm Bomby x mori L.using a piggyBac transposon-derived vector[J].Nat Biotechnol.2000,18(1):81-4.

[2]Imamura M,Nakai J,Inoue S,Quan GX,Kanda T,Tamura T.Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bomby x mori[J].Genetics.2003,165(3):1329-40.

[3]Uh lí rová M,Asahina M,Riddiford LM,Jindra M.Heat-inducible transgenic expression in the silkmoth Bombyx mori[J].Dev Genes Evol.2002,212(3):145-51.

[4]Dai H,Jiang R,Wang J,Xu G,Cao M,Wang Z,Fei J.Development of a heat shock inducible and inheritable RNAi system in silkworm[J].Biomol Eng.2007,24(6):625-30.

[5]楊惠娟,莊蘭芳,范偉,蘭天云,丁農(nóng),陸長德,鐘伯雄.A3啟動(dòng)子缺陷piggyBac轉(zhuǎn)座子在家蠶中的轉(zhuǎn)基因研究[J].蠶業(yè)科學(xué),2008,34(1):41-4.

[6]Uchino K,Sezutsu H,Imamura M,Kobayashi I,Tatematsu K,Iizuka T,Yonemura N,Mita K,Tamura T.Construction of a piggyBac-based enhancer trap system for the analysis of gene function in silkworm Bombyx mori[J].Insect Biochem Mol Biol.2008,38(12):1165-73.

[7]Tan A,Tanaka H,Tamura T,Shiotsuki T.Precocious metamorphosis in transgenic silkworms overexpressing juvenile hormone esterase[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2005,102(33):11751-6.

[8]Funaguma S,Suzuki MG,Tamura T,Shimada T.The Bmdsx transgene including trimmed introns is sex-specifically spliced in tissues of the silkworm,Bombyx mori[J].J Insect Sci.2005,5:17.

[9]Sakudoh T,Sezutsu H,Nakashima T,Kobayashi I,Fujimoto H,Uchino K,Banno Y,Iwano H,Maekawa H,Tamura T,Kataoka H,Tsuchida K.Carotenoid silk coloration is controlled by a carotenoid-binding protein,a product of the Yellow blood gene[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104(21):8941-6.

[10]Quan G,Kobayashi I,Kojima K,Uchino K,Kanda T,Sezutsu H,Shimada T,Tamura T.Rescue of white egg 1 mutant by introduction of the wildtype Bombyx kynurenine 3-monooxygenase gene[J].J In-sect Sci.2007,14:85-92.

[11]Dai H,Ma L,Wang J,Jiang R,Wang Z,Fei J.Knockdown of ecdysis-triggering hormone gene with a binary UAS/GAL4 RNA interference system leads to lethal ecdysis deficiency in silkworm[J].Acta Biochim Biophys Sin.2008,40(9):790-5.

[12]Thomas JL,Da Rocha M,Besse A,Mauchamp B,Chavancy G.3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stage onwards[J].Insect Biochem Mol Biol.2002,32(3):247-53.

[13]Yamamoto M,Yamao M,Nishiyama H,Sugihara S,Nagaoka S,Tomita M,Yoshizato K,Tamura T,Mori H.New and highly efficient method for silkworm transgenesis using Autographa californica nucleopolyhedrovirus and piggyBac transposable elements[J].Biotechnol Bioeng.2004,88(7):849-53.

[14]代紅久,徐國江,Thomas J,王鑄鋼,蔣容靜,費(fèi)儉.利用鱗翅目來源的轉(zhuǎn)座子piggyBac建立高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)[J].科學(xué)通報(bào).2005,50(14):1470-4.

[15]Royer C,Jalabert A,Da Rocha M,Grenier AM,M auchamp B,Couble P,Chavancy G.Biosynthesis and cocoon-export of a recombinant globular protein in transgenic silkworms[J].Transgenic Res.2005,14(4):463-72.

[16]Kanginakudru S,Royer C,Edupalli SV,Jalabert A,Mauchamp B;Chandrashekaraiah,Prasad SV,Chavancy G,Couble P,Nagaraju J.Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms[J].Insect Mol Biol.2007,16(5):635-44.

[17]Handler AM,McCombs SD,Fraser MJ,Saul SH.The lepidopteran transposon vector,piggyBac,mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly[J].Proc Natl Acad Sci U S A.1998,95(13):7520-5.

[18]Wang W,Lin C,Lu D,Ning Z,Cox T,Melvin D,Wang X,Bradley A,Liu P.Chromosomal transposition of piggyBac in mouse embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2008,105(27):9290-5.

[19]Liang Q,Kong J,Stalker J,Bradley A.Chromosomal mobilization and reintegration of Sleeping Beauty and piggyBac transposons[J].Genesis.2009,47(6):404-8.

[20]Galvan DL,Nakazawa Y,Kaja A,Kettlun C,Cooper LJ,Rooney CM,Wilson MH.Genome-wide mapping of piggyBac transposon integrations in primary human T cells[J].J Immunother.2009,32(8):837-44.

[21]Balu B,Chauhan C,Maher SP,Shoue DA,Kissinger JC,Fraser MJ Jr,Adams JH.piggyBac is an effective tool for functional analysis of the Plasmodium falciparum genome[J].BMC Microbiol.2009,9:83.