任為聰，程建軍,*，張智宇，趙偉華，江連洲,2

酶改性對高溫變性豆粕溶解性的影響

任為聰1，程建軍1,*，張智宇1，趙偉華1，江連洲1,2

(1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用堿性蛋白酶改性提高高溫變性豆粕的溶解性。以氮溶解指數(shù)(NSI)為指標，考察pH值、底物質量濃度、加酶量、溫度、時間對高溫變性豆粕NSI的影響。通過單因素和響應面試驗確定優(yōu)化酶解高溫變性豆粕的工藝條件，在pH9.0、底物質量濃度8.56g/100mL、加酶量13004.69U/g pro、溫度59.10℃、時間20.47min時，水解度(DH)雖然為15.86%，但NSI值從21.24%達到了92.58%。

酶法改性；高溫變性豆粕；響應面；NSI

大豆蛋白是一種優(yōu)質的植物蛋白質資源，尤其具有較好的功能特性[1]，其中一些重要的功能特性依賴于蛋白質的溶解性才能得以體現(xiàn)，因此，蛋白質的溶解性在一定程度上決定了蛋白質的功能特性[2]。高溫變性豆粕是大豆煉油后的副產物，煉油工藝中高溫脫溶步驟造成蛋白質的熱變性，導致了高溫變性豆粕的蛋白質溶解性較差。為了提高蛋白質的溶解性，可以進行物理、化學和生物酶法等的處理[3]。其中生物酶方法較為溫和，酶所特有的專一性能夠斷裂肽鏈，使原本暴露在蛋白質高級結構外部的疏水性氨基酸殘基被斷裂，使得蛋白質溶解性提高[4]。Sara等[5]和Lee等[6]利用單酶或復合酶對大豆分離蛋白改性后水解物與天然態(tài)相比，其溶解度大大提高。Walsh等[7]對大豆分離蛋白先用Alcalase限制性水解，再用谷氨酰胺轉移酶交聯(lián)化處理，結果發(fā)現(xiàn)蛋白質在等電點附近具有較高溶解性，經(jīng)這種方法處理大豆蛋白在低酸性食品和飲料中有很大用途。隨著控制性酶解技術的成熟，大量研究者投身其中，Tsumura等[8]控制性水解大豆分離蛋白的β半球蛋白和球蛋白，結果發(fā)現(xiàn)β半球蛋白水解液凍干粉在pH 7.0和8.0時的溶解性高于大豆分離蛋白的溶解性。Lamsal等[9]認為限制性水解使得可電離氨基酸和羧基基團大量暴露，致使限制性水解后的蛋白溶解性明顯高于未水解對照樣。近些年，隨著響應曲面試驗方法在酶解中的應用，許多國外研究者利用此方法對水解過程中蛋白質溶解性、氨基氮等進行響應面優(yōu)化設計[10-14]，使得對酶解工藝的優(yōu)化更加方便。

1 材料與方法

1.1 材料

高溫變性豆粕 黑龍江省雙鴨山市楊霖油脂廠。

1.2 試劑與儀器

Alaclase蛋白酶(酶活力198638.3U/mL) 丹麥Novo

公司；3,5-二硝基水楊酸(DNS)為化學純；其他試劑均為國產分析純。

HYP-2型消化爐 上海纖檢儀器有限公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；THZ-82型恒溫水浴振蕩器 金壇市億通電子儀器有限公司；電動攪拌槳 金壇市中大儀器廠；飛鴿TDL-40B離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠；TDW馬弗爐 溫州市雙嶼儀器廠。

1.3 測定方法

蛋白質含量測定：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》；粗脂肪測定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；灰分測定：GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》；水分測定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；粗纖維測定：GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》；總糖含量測定參照文獻[15]；酶活力測定：按照福林-酚法(SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》)；水解度測定：pH-stat方法，參照文獻[16]。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備

高溫豆粕粉碎過80目篩，備用。

1.4.2 堿性蛋白酶改性過程

過80目篩樣品→加水調節(jié)適當濃度→調節(jié)適當pH值→加堿性蛋白酶→用2mol/L的NaOH溶液調pH值進行水解→酶解液→沸水浴滅酶活→離心分離→測定上清液蛋白質含量和水解度(DH)值

1.4.3 酶解工藝及響應面優(yōu)化設計

表1 試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in response surface design

以不同的pH值、底物質量濃度、加酶量、溫度和時間進行各單因素試驗。為得到高溶解性的高溫變性豆粕可溶性蛋白質，得堿性蛋白酶酶解的最佳工藝參數(shù)，在單因素試驗的基礎上，以pH(x1)、底物質量濃度(x2)、加酶量(x3)、溫度(x4)和時間(x5)5個因素為自變量，NSI為響應值，設計5因素5水平(1/2實施)的二次回歸方程，擬合因素和指標(響應值Y)之間的函數(shù)關系，用響應面分析法尋求酶解最優(yōu)工藝參數(shù)。其試驗因素水平選取見表1，方案與結果見表3，每個試驗點均做3個平行樣，取其平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應用Design-Expert 7.1軟件(Stat Ease, Inc, Minneapolis，USA)；SPSS13.0；Microsoft Excel 2003處理數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 高溫變性豆粕部分指標測定

由表2可知，高溫變性豆粕的蛋白質含量(干基)可達到49%左右，蛋白質資源豐富，但其可溶性蛋白質含量僅占蛋白質總量的21%左右，由于熱變性的原因，蛋白質高級結構變化，肽鏈松散，大部分疏水基團大量暴露在蛋白質肽鏈外部，這是導致蛋白質溶解性下降的根本原因[2]。

2.2 酶改性單因素試驗

2.2.1 pH值對NSI和DH的影響

圖1 pH值對NSI和DH的影響Fig.1 Effect of pH on solubility and DH of high-temperature denatured soybean meal

配制底物質量濃度5g/100mL的溶液，添加酶2000U/g pro，55℃，反應5min條件下，調節(jié)不同的pH值。結果如圖1所示，隨著pH值增加到8.5，溶液的NSI值急劇上

升到77.51%，隨后趨于平緩。DH值隨pH值的增加，從2.37%急劇上升到4.06%。在pH8.5酶解時不溶性蛋白質結構被改變，造成蛋白質不溶解的疏水性基團被破壞，斷裂成長肽鏈，使溶解性提高[4]。升高pH值對于酶繼續(xù)斷裂已溶解的肽鏈進行水解是有利的，但對提高NSI值效果不顯著，過高的pH值使蛋白質形成有毒聚合物[17]。

表2 高溫變性豆粕主要成分指標分析結果Table 2 General chemical composition of high-temperature denatured soybean meal

2.2.2 底物質量濃度對NSI和DH的影響

圖2 底物質量濃度對NSI和DH的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，添加酶2000U/g pro，55℃，反應5min條件下，調節(jié)不同的底物質量濃度，結果如圖2。底物質量濃度增加到9g/100mL，NSI值緩慢下降到77.72%，隨后急劇下降，在此過程中，DH值先升高再下降，在底物質量濃度為7g/100mL時，達到2.92%。過高底物質量濃度使得酶不易與底物相互作用，造成NSI和DH的下降。

2.2.3 加酶量對NSI和DH的影響

圖3 加酶量對NSI和DH的影響Fig.3 Effect of enzyme loading on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，底物質量濃度9g/100mL，55℃，反應5min條件下，調節(jié)不同的加酶量，結果如圖3。隨著加酶量的增加，NSI和DH值均急劇升高，達到12000U/g pro后，酶解不溶性蛋白質生成可溶性肽鏈相對穩(wěn)定，NSI值變化不顯著。繼續(xù)增加加酶量，適合繼續(xù)酶解已溶解的長肽鏈，使斷裂成更短的小肽鏈，DH值繼續(xù)升高，但對NSI值變化影響不大。

2.2.4 溫度對NSI和DH的影響

圖4 溫度對NSI和DH的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，底物質量濃度9g/100mL，加酶量12000U/g pro，反應5min條件下，調節(jié)不同的反應溫度，結果如圖4。隨著溫度的升高到達60℃，NSI和DH值均上升，分別達到83.43%和8.48%，隨后開始下降。由于酶對溫度十分敏感，過低的溫度均使酶達不到最佳酶活，過高的溫度使酶結構開始發(fā)生變化，酶活性降低。

2.2.5 酶解時間對NSI和DH的影響

圖5 酶解時間對NSI和DH的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，底物質量濃度9g/100mL，加酶量12000U/g pro，在60℃條件下，調節(jié)不同的反應時間，結果如圖5。隨時間的延長，NSI和DH值均上升，當達到20min后，NSI值變化不顯著，DH值繼續(xù)上升。由于酶解20min后不溶性蛋白質的疏水區(qū)域基本被破壞，蛋白質基本以大肽鏈形式存在于溶液中，使得NSI值趨于穩(wěn)定，但酶仍在繼續(xù)酶解這些大肽鏈，得其變成小肽，因此，DH值仍繼續(xù)上升。

2.3 響應面試驗結果與分析

經(jīng)Design-Expert 7.1進行二次回歸分析，根據(jù)方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗的結果，將差異不顯著的因素剔除后得到的回歸方程為：

通過進行方差分析驗證模型及各參數(shù)的顯著性，結果見表4。

表3 響應面試驗結果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

2.4 模型分析

模型中的參數(shù)x1、x2、x3、x4、x5、x1x4、x3x5、x1、x2、x3、x4、x5都是顯著的(P＜0.05)。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率[18]。模型失擬項P為0.0678＞0.05，因此，模型失擬項不顯著。模型決定系數(shù)R2為0.9363，擬合度較好。經(jīng)過回歸分析得出因素x1(pH)和x4(溫度)、x3(加酶量)和x5(時間)對考察指標NSI交互作用顯著。

2.5 最適條件的模型驗證

綜合考慮各項試驗因素及其相互作用，根據(jù)二次多項回歸方程，利用Design-Expert 7.1設計軟件優(yōu)化出酶法改性高溫變性豆粕溶解性的最適工藝條件為：pH9.0、底物質量濃度8.56g/100mL、加酶量13004.69U/g pro、溫度59.10℃、時間20.47min。此條件下的NSI值為92.58%，與模型預測值93.01%的相對誤差為0.46%，差異不顯著，這表明模型是合理有效的，此時DH值為15.86%。

表4 響應面試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis for the developed prediction model for NSI

3 結 論

通過各單因素試驗，發(fā)現(xiàn)高溫變性豆粕溶液在酶解過程中，NSI和DH值增長趨勢并不完全相同。

通過響應面分析得到了酶改性條件與高溫變性豆粕NSI值的回歸模型為：Y= －505.65563+ 87.42417x1－ 0.36437x2+5.74312×10-3x3+4.93313x4+2.27067x5－ 0.28675x1x4－1.02937×10-4x3x5－3.95000x12－1.22500× 10-7x23－0.019700x24－0.021250x25，并優(yōu)化出最佳工藝條件為：pH9.0、底物質量濃度8.56g/100mL、加酶量13004.69U/g pro、溫度59.10℃、時間20.47min，在此條件下DH值為15.86%，NSI值為92.58%。

通過回歸分析得出因素x1(pH)和x4(溫度)、x3(加酶量)和x5(時間)對考察指標NSI交互作用顯著。

[1]馮屏, 徐玉佩. 功能性大豆蛋白及其應用[J]. 中國油脂, 2001, 26(6):

70-74.

[2]趙新淮, 徐紅華, 姜毓君. 蛋白質結構與功能性[M]. 北京: 中國青年出版社, 2009.

[3]田其英, 華欲飛. 大豆蛋白溶解性研究[J]. 糧食與油脂, 2006(6): 6-8.

[4]JENS A N. Enzymatic hydrolysis of proteins for increased solubility[J]. J Agric Food Chem, 1976, 24(6): 1090-1093.

[5]SARA E M O B, JORGE R W C. Hydrolysates of native and modified soy protein isolates: structural charaeteristies, solubility and foaming properties[J]. Food Research Intemational, 2002, 35: 511-518.

[6]LEE J Y, LEE H D, LEE C H. Characteriztion of hydrolysates produced by mild-acid treatment and enzymatic hydrolysis of defatted soybean flour[J]. Food Research Intemational, 2001, 34: 217-222.

[7]WALSH D J, CLEARY D, MECARTHY E, et al. Modifieation of the nitrogen solubility properties of soy protein isolate following proteolysis and transglutalninase cross-linking[J]. Food Research International, 2003, 36: 677-683.

[8]TSUMURA K, SAITO T, TSUGE K, et al. Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis[J]. LWT, 2005, 38: 255-261.

[9]LAMSAL B P, JUNG S, JOHNSON L A. Rheological properties of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis[J]. LWT, 2007, 40: 1215-1223.

[10]BHASKAR N, BENILA T, RADHA C, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of Catla (Catla catla) for preparing protein hydrolysate using a commercial protease[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 335-343.

[11]NILSANG S, LERTSIRI S, SUPHANTHARIKA M, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases[J]. Journal of Food Engineering, 2005, 70: 571-578.

[12]PERICIN D, RADULOVIC-POPOVIC L, VASTAG Z, et al. Enzymatic hydrolysis of protein isolate from hull-less pumpkin oil cake: Application of response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2009, 115: 753-757.

[13]SUROWKA K, ZMUDZINSKI D, FIK M. New protein preparations from soy flour obtained by limited enzymic hydrolysis of extrudates[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2004, 5: 225-234.

[14]SUROWKA K, ZMUDZINSKI D, SUROWKA J. Enzymic modification of extruded soy protein concentrates as a method of obtaining new functional food components[J]. Trends in Food Science & Technology, 2004, 15: 153-160.

[15]孫偉偉, 曹維強, 王靜. DNS法測定玉米秸稈中總糖[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 26(6): 120-123.

[16]SPELLMAN D, MCEVOY E, O’CUINN G, et al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2003, 13: 447-453.

[17]石彥國, 任莉. 大豆制品工藝學[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1993: 90-96.

[18]王欽德, 楊堅. 食品試驗設計與統(tǒng)計分析[M]. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2003.

Effect of Enzymatic Modification on Solubility of High-temperature Denatured Soybean Meal

REN Wei-cong1，CHENG Jian-jun1,*，ZHANG Zhi-yu1，ZHAO Wei-hua1，JIANG Lian-zhou1,2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Soybean Engineering and Technique Research Center, Harbin 150030, China)

The effect of alkaline portease modification on the nitrogen solubility index (NSI) of high-temperature denatured soybean meal was investigated. The optimal conditions for the enzymatic hydrolysis of high-temperature denatured soybean meal were explored by single factor method and response surface analysis. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were found to be: substrate concentration, 8.56 g/100mL; enzyme loading, 13004.69 U/g pro; hydrolysis pH 9.0, hydrolysis temperature, 59.10 ℃; and hydrolysis time, 20.47 min. The degree of hydrolysis (DH) was 15.86% under the optimal hydrolysis conditions, and the NSI was 92.58%, much higher than that before the hydrolysis of 21.24%.

enzymatic modification；high-temperature denatured soybean meal； response surface analysis；NSI

TS214.2

A

1002-6630(2010)21-0137-05

2010-08-08

黑龍江省科技計劃項目(GB08B401-02)

任為聰(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為農產品加工與儲藏。E-mail：dacong851120@163.com

*通信作者：程建軍(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為植物蛋白與多糖的綜合利用。E-mail：cheng577@163.com