周 熒，潘思軼*

大豆異黃酮組分在腐乳后酵過(guò)程中的變化

周 熒，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

研究腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組成和含量的變化。結(jié)果表明：在腐乳后酵過(guò)程中，大豆異黃酮總含量呈下降趨勢(shì)；當(dāng)食鹽含量較低時(shí)，糖苷(daidzin和genistin)分解較快；大豆異黃酮糖苷形式(daidzin和genistin)轉(zhuǎn)化為苷元形式(daidzein和genistein)。說(shuō)明腐乳后酵有效提高了大豆異黃酮的生物活性。

腐乳；大豆異黃酮；后酵；食鹽

腐乳是我國(guó)傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、價(jià)格低廉，受到國(guó)內(nèi)外食品及營(yíng)養(yǎng)學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。

大豆異黃酮(soybean isoflavones，ISO)是大豆中一類(lèi)多酚化合物的總稱(chēng)，是非固醇類(lèi)物質(zhì)，具有廣泛營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值及健康保護(hù)作用。大豆異黃酮的生物學(xué)活性主要包括抗血管生成、抑制細(xì)胞增殖和分化、抑制激素結(jié)合球蛋白(SHBG)合成、抗氧化活性等[2-3]。豆制品中大豆異黃酮的總回收率和分布概況取決于其加工技術(shù)，如熱處理、消泡、酶水解和發(fā)酵[4-7]。

腐乳作為中國(guó)的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品有著十分廣闊的發(fā)展空間，但是大豆異黃酮在腐乳發(fā)酵過(guò)程中的變化研究在國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分和含量的變化，以及食鹽含量對(duì)大豆異黃酮的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北大豆 市售；毛霉 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院研究室。

大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品 西安易樂(lè)生物科技有限公司；熟石膏、精制碘鹽、食用酒精、香辛料、面黃、紅曲均為市售。甲醇(色譜純) Dima Technology公司；乙醇(分析純) 上海振興化工一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1-4LD冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Alpha公司；高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 腐乳的制備[8]

1.3.1.1 孢子懸浮液的制備

1)PDA培養(yǎng)基制備：馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000mL，加葡萄糖20g，瓊脂15g，溶化后分裝，滅菌30min。2)固體斜面培養(yǎng)：毛霉在PDA斜面培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)5d(菌種在4℃保藏，使用時(shí)需重新活化)。

3)經(jīng)過(guò)上述擴(kuò)大培養(yǎng)后，制備成孢子懸浮液。

1.3.1.2 腐乳白坯的制備

大豆經(jīng)篩選、浸泡、磨豆、濾漿、煮漿、過(guò)篩、石膏點(diǎn)漿、蹲腦、上榨、壓榨、降溫后劃塊使之成為4cm×4cm×3cm的白坯。

1.3.1.3 腐乳前酵的操作

將腐乳白坯接種配制好的孢子懸浮液，擺籠后，在28℃、相對(duì)濕度大于90%的條件下培養(yǎng)。36h后，白坯表面布滿菌絲，經(jīng)搓毛后即為腐乳毛坯。

1.3.1.4 腐乳鹽腌的操作

準(zhǔn)確計(jì)量毛坯，在壇底撒一層鹽，將毛坯整齊擺在上面，每擺一層撒一層鹽，下少上多，共腌制7d。

1.3.1.5 腐乳后酵的操作

將腐乳鹽坯撈起、瀝干、裝入400mL容量的腐乳專(zhuān)用玻璃方瓶中，每瓶裝鹽坯8塊，加入無(wú)鹽后酵湯料，用瓶蓋擰緊瓶口，放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行腐乳后酵成熟。

1.3.1.6 腐乳發(fā)酵過(guò)程中的取樣方法

后酵50d，每5d取一次樣，每次取樣8塊。

1.3.2 腐乳發(fā)酵樣品中異黃酮的提取

樣品→真空冷凍干燥72h→粉碎機(jī)磨至80目→取5g粉樣，加入80%乙醇提取液200mL索氏提取7h→80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液，加甲醇復(fù)溶，定容至60mL→取少量上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾→轉(zhuǎn)入HPLC專(zhuān)用小瓶備用

1.3.3 大豆異黃酮高效液相色譜(HPLC)分析

色譜柱：Thermo-Hypersil GOLD(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸的水溶液，流動(dòng)相B：甲醇溶液(流動(dòng)相條件見(jiàn)表1)；流量：0.8mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。

表1 高效液相色譜儀的流動(dòng)相條件Table 1 Mobile phase conditions of HPLC

1.3.4 腐乳中食鹽含量的測(cè)定

采用A g N O3滴定法[9]測(cè)定腐乳中食鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同食鹽含量的腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮含量的變化由圖1可知，在腐乳后酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆異黃酮的總含量呈下降趨勢(shì)。由于大豆異黃酮的糖苷形式逐漸轉(zhuǎn)化成其苷元形式，而糖苷是大分子物質(zhì)，其分子質(zhì)量大于苷元，所以大豆異黃酮的總含量有所減少；同時(shí)由于無(wú)鹽湯料的加入使一小部分大豆異黃酮溶入湯料中[8-10]，從而使大豆異黃酮的含量有所減少，但后酵過(guò)程對(duì)大豆異黃酮含量的影響不大。

同時(shí)，食鹽含量為15%的樣品中大豆異黃酮的含量高于食鹽含量為10%的樣品，原因可能是：在腐乳后酵階段中，較高食鹽含量下的腐乳的發(fā)酵過(guò)程較緩慢，所以被微生物利用的大豆異黃酮較少，從而使未被利用和殘留的大豆異黃酮較多，導(dǎo)致腐乳中大豆異黃酮的含量較高。

2.2 不同食鹽含量的腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分daidzin的變化

圖2 腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分daidzin含量的變化Fig.2 Change in daidzin content of sufu during post-fermentation process

由圖2可知，腐乳在后酵過(guò)程中，大豆異黃酮組分daidzin的含量逐漸下降，直至無(wú)法檢出，說(shuō)明在后酵階段daidzin幾乎完全分解。食鹽含量為10%腐乳中的daidzin和食鹽含量為15%腐乳中的daidzin分別在后酵第25天和第30天開(kāi)始無(wú)法檢出，可以看出在腐乳后酵過(guò)程中食鹽含量較低時(shí)糖苷分解較快，這是由于食鹽

對(duì)抑制酶的活性有抑制作用[5,8,10]，因此較高食鹽含量樣品的酶活較低，酶解時(shí)間較長(zhǎng)。

2.3 不同食鹽含量的腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分daidzein的變化

圖3 腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分daidzein含量的變化Fig.3 Change in daidzein content of sufu during post-fermentation process

由圖3可知，腐乳在后酵過(guò)程中，隨著大豆異黃酮組分daidzin含量的逐漸降低，其相應(yīng)的苷元形式daidzein的含量明顯增加，并達(dá)到最大值后下降。由于毛霉在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的外源性β-葡萄糖苷酶，毛坯中大豆異黃酮糖苷daidzin迅速分解，而相應(yīng)的苷元daidzein的含量逐漸上升。食鹽含量為10%腐乳中的daidzein在后酵第20天達(dá)到最大值117.80μg/g，食鹽含量為15%腐乳中的daidzein在后酵第25天達(dá)到最大值119.96μg/g。

2.4 不同食鹽含量的腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分genistin的變化

圖4 腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分genistin含量的變化Fig.4 Change in genistin content of sufu during post-fermentation process

由圖4可知，腐乳在后酵過(guò)程中，大豆異黃酮組分genistin的含量逐漸下降，直至無(wú)法檢出，說(shuō)明在后酵階段genistin幾乎完全分解。說(shuō)明在后酵階段genistin幾乎完全分解。食鹽含量為10%腐乳中的genistin和食鹽含量為15%腐乳中的genistin分別在后酵第30天和第40天開(kāi)始無(wú)法檢出，可以看出在腐乳后酵過(guò)程中食鹽含量較低時(shí)糖苷分解較快，這是由于食鹽對(duì)抑制酶的活性有抑制作用[5,8,10]，因此較高食鹽含量樣品的酶活較低，酶解時(shí)間較長(zhǎng)。

2.5 不同食鹽含量的腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分genistein的變化

圖5 腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮組分genistein含量的變化Fig.5 Change in genistein content of sufu during post-fermentation process

如圖5所示，腐乳在后酵過(guò)程中，隨著大豆異黃酮組分genistin含量的逐漸降低，其相應(yīng)的苷元形式genistein的含量明顯增加，并達(dá)到最大值后下降。食鹽含量為10%腐乳中的genistein在后酵第35天達(dá)到最大值187.83μg/g，食鹽含量為15%腐乳中的genistein在后酵第25天達(dá)到最大值196.67μg/g。

有研究報(bào)告顯示，游離的異黃酮苷元比糖苷具有更廣泛的生物學(xué)活性，未被水解的糖苷具有較高的親水性與較大的分子質(zhì)量，而且在小腸中的吸收率遠(yuǎn)低于游離的苷元[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮糖苷形式幾乎完全分解轉(zhuǎn)化成為苷元形式，說(shuō)明腐乳制造有效提高了大豆異黃酮的生物活性。

3 結(jié) 論

3.1 在腐乳后酵過(guò)程中，大豆異黃酮的總含量呈下降趨勢(shì)；但后酵過(guò)程對(duì)大豆異黃酮總含量的影響不大。

3.2 在后酵過(guò)程中食鹽含量較低時(shí)，糖苷(daidzin和genistin)分解較快。

3.3 在腐乳后酵過(guò)程中大豆異黃酮糖苷形式(daidzin和genistin)幾乎完全分解轉(zhuǎn)化成為苷元形式(daidzein和genistein)，說(shuō)明腐乳制造有效提高了大豆異黃酮的生物活性。

[1]HAN Beizhong, ROMBOUTS F M, NOUT M J R. A Chinese fermented soybean food[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 65(1/2):1-10.

[2]崔洪斌. 大豆生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2001:1-12.

[3]劉志勝, 李里特, 辰巳英三. 大豆異黃酮及其生理功能研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技, 2000(1): 78-80.

[4]ANDERSON R, WOLF W. Composition changes in trypsin inhibitor, phytic acid, saponins and isoflavones related to soybean processing[J].

Journal of Nutrition, 1995, 125: 581s-588s.

[5]WANG H, MURPHY P A. Mass balance study of isoflavone during soybean processing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44: 2377-2383.

[6]WANG H, MURPHY P A. Isoflavone content in commercial soybean foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994a, 42: 1666-1673.

[7]WANG H, MURPHY P A. Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in Iowa: Effects of variety; crop year, and location[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994b, 42: 1674-1677.

[8]YIN Lijun, LI Lite, LI Zaigui. Changes in isoflavone contents and composition of sufu (fermented tofu) during manufacturing[J]. Food Chemistry, 2004, 87(4): 587-592.

[9]朱壽珩. 定量分析[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 1994.

[10]COWARD L, BARNES N C, KENNETH D R, et al. Genistein, daidzein, and theirβ- glycoside conjugates: Antitumor isoflavones in soybean foods from American and Asian diets[J]. J Agric Food Chem, 1993, 41: 1961-1967.

[11]HUTCHINS A M, SLAVIN J L, LAMPE J W. Urinary isoflavonoid phytoestrogen and lignan excretion after consumption of fermented and unfermented soy products[J]. J Am Diet Assoc, 1995, 95(5): 545-551.

[12]ONOZAWA M, FUKUDA K, OHTANI M, et al. Effect of soybean isoflavones on cell growth and apoptosis of the human prostatic cancer cell line LNCaP[J]. Japanese Journal of Clinical Oncology, 1998, 28: 360-363.

[13]PETERSON G, BARNES S. Genistein inhibition of the growth of human breast cancer cells: Independence from estrogen receptors and the multi-drug resistance gene[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999, 179: 661-667.

[14]PISKULA M K, YAMAKOSHI J, IWAI Y. Daidzein and genistein but not their glucosides are absorbed from the rat stomach[J]. FEBS Letters, 1999, 447: 287-291.

Change in Isoflavone Composition in Sufu during Post-fermentation Process

ZHOU Ying，PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this study, the changes in type and amount of isoflavone in sufu (fermented bean curd) during post-fermentation process were measured. The results indicated that the total content of isoflavones in sufu exhibited a gradual decrease during post-fermentation process. A rapid degradation of isoflavone glucosides such as daidzin and genistin was observed under low salt conditions, which were completely transformed into isoflavone aglycones including daidzein and genistein during post-fermentation process. Therefore, post-fermentation might be beneficial to enhance the physiological function of sufu.

sufu；isoflavone；post-fermentation process；NaCl

O623.54

A

1002-6630(2010)21-0101-04

2010-01-28

湖北省科技廳重點(diǎn)科技專(zhuān)項(xiàng)(2006AA201B29)；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2007-620)

周熒(1984—)，女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工化學(xué)研究。E-mail：sabrinazhou21@yahoo.com.cn

*通信作者：潘思軼(1964—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工化學(xué)研究。E-mail：pansiyi@mail.hzau.edu.cn