張春寶 何世學(xué) 何芳 李媛媛 陳剛 高洪志 郝光濤

克拉霉素(Clarithromycin)是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，適用于革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌、厭氧菌及支原體、衣原體等非典型病原體所引起的感染。因其吸收后血藥濃度低，有必要建立選擇性好、靈敏的分析方法測定其血藥濃度，研究其臨床藥代動(dòng)力學(xué)［1－6］。國內(nèi)外對(duì)生物樣本中克拉霉素的測定方法有氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法等，但很多方法都存在一定的局限性，如樣本處理過程復(fù)雜，色譜條件復(fù)雜(梯度洗脫)等，為了研究克拉霉素磷酸酯片的人體藥代動(dòng)力學(xué)，本實(shí)驗(yàn)擬建立高效靈敏準(zhǔn)確專屬性強(qiáng)的方法以測定人血漿中克拉霉素濃度。

1 對(duì)象與方法

1．1 儀器與試劑 API3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子化源(ESI)，色譜工作站為Analyst1．4．2數(shù)據(jù)處理軟件 (美國AB公司)，液相色譜儀是島津(SHIMADZU)高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱?？死顾貙?duì)照品購于中國藥品生物制品檢定所，含量為99．0%，批號(hào):30356-200403;替米沙坦對(duì)照品(內(nèi)標(biāo))由北京昭衍新藥研究中心提供，批號(hào):010600160，純度99．5%。甲醇和甲酸均為色譜純，為Dikma公司產(chǎn)品;試驗(yàn)用水為去離子水，是本實(shí)驗(yàn)室自制;其他試劑為AR試劑。

1．2 溶液的配制

1．2．1 克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱取克拉霉素對(duì)照品10．0 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200．0μg/ml克拉霉素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1．2．2 克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取上述儲(chǔ)備液以甲醇依次倍比稀釋，配成濃度分別為 10、25、100、200、500、1 500 和3 000 ng/ml，即得。

1．2．3 內(nèi)標(biāo)(替米沙坦)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱取替米沙坦對(duì)照品10．0 mg，置于50 m l容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200．0μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，取該儲(chǔ)備液加入甲醇倍比稀釋至200 ng/ml，作為內(nèi)標(biāo)工作溶液，并將其置于4℃冰箱保存待用。

1．3 血漿樣品分析方法 精密量取50μl血漿樣品，置于1．5 ml EP試管中，分別加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液 (200 ng/ml替米沙坦甲醇溶液)、50μl甲醇，并補(bǔ)加350甲醇溶液，渦旋混合30 s，15 000 r/min 低溫4℃離心 10 min，取上清液進(jìn)樣 2 μl，進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)法(HPLC-MS/MS)分析。

1．4 色譜及質(zhì)譜條件

1．4．1 色譜條件:色譜柱:Agilent-XDB-C8柱 (2．1×150 mm，5 μm)，USA; 流動(dòng)相∶甲醇∶水(含0．1%甲酸)=85∶15(V∶V);流速:0．2 m l/min;柱溫:20℃;進(jìn)樣量:2 μl。

1．4．2 質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子化源(ESI源);離子極性:正離子(Positive);離子檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式;噴射電壓:5 500 V;離子源溫度:450℃;源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力:40psi;源內(nèi)氣體2(GS2，N2)壓力:40psi;氣簾氣體(N2)壓力:15psi;碰撞氣(CAD，N2)壓力:5 psi;CE電壓:分別為50 V(克拉霉素)，63 V(替米沙坦，內(nèi)標(biāo));DP電壓(解簇電壓)分別為55 V(克拉霉素)，90 V(替米沙坦，內(nèi)標(biāo));用于定量分析的離子反應(yīng)對(duì)分別為質(zhì)荷比(m/z)748．4→m/z 158．2(克拉霉素) 和 m/z 515．3→m/z 276．2(替米沙坦，內(nèi)標(biāo))。

2 結(jié)果

2．1 質(zhì)譜分析 取克拉霉素和替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量用甲醇稀釋成濃度為100μg/ml的甲醇溶液，按“1．4．2質(zhì)譜條件”項(xiàng)操作，相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 克拉霉素和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

2．2 特異性 分別取6個(gè)不同人的空白血漿50μl，除不加內(nèi)標(biāo)溶液并另外補(bǔ)加50μl甲醇外，其余按“3血漿樣品分析方法”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣2μl，獲得空白樣品的色譜圖:2-A;將一定濃度的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)替米沙坦溶液加入空白血漿中，依同法進(jìn)行樣品處理，獲得相應(yīng)的色譜圖:2-B(最低定量限)、2-C(標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度)。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾克拉霉素和替米沙坦的測定。

圖2 血漿中克拉霉素和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的典型MRM色譜圖(Ⅰ克拉霉素;Ⅱ替米沙坦)

2．3 相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)考察 分別取6個(gè)不同受試者空白血漿(即受試者0 h血漿)50μl于1．5 m l EP試管中，然后各加入克拉霉素最低濃度(10 ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl和內(nèi)標(biāo)50μl，按“1．3血漿樣品分析方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣量為2μl，每個(gè)空白血漿各做3份;并同時(shí)做一條隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品實(shí)測濃度。結(jié)果顯示所有試驗(yàn)測定值與標(biāo)示量的相對(duì)偏差 (RE%)均在 ±20%之間，精密度為 5．52(＜15%)，則可認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2．4 血漿中克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及定量下限的確定 取人空白血漿50μl，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的克拉霉素對(duì)照品溶液50μl和內(nèi)標(biāo)溶液50μl，旋渦混勻，配成含克拉霉素的濃度分別為 10、25、100、200、500、1 500 和 3 000 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“3血漿樣品分析方法”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，計(jì)算克拉霉素峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)。以血漿中待測物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得回歸方程(圖3):Y=0．00257X+0．00441，r=0．9989，權(quán)重系數(shù)w=1/χ2。按上述條件克拉霉素在血漿中的定量下限(LLOQ)為10 ng/ml。配制克拉霉素濃度為10 ng/ml血漿樣品5份，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，記錄色譜圖，計(jì)算克拉霉素峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，按照當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得實(shí)測濃度及實(shí)測濃度準(zhǔn)確度，并計(jì)算RSD，結(jié)果表明所有試驗(yàn)測定值與標(biāo)示量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)均在±15%之間。

圖3 HPLC-MS/MS法測定人血漿中克拉霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．5 精密度試驗(yàn) 取1．5 ml EP試管數(shù)支，按“2．4血漿中克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及定量下線的確定”項(xiàng)制備含克拉霉素濃度分別為25、400、2 500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿(每個(gè)濃度做6份樣品)及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“1．3血漿樣品分析方法”項(xiàng)下操作。每天做一批及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，連續(xù)做3 d，共三批，每批每個(gè)濃度做6份樣品，記錄色譜圖，計(jì)算克拉霉素峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測濃度，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。見表1。

表1 HPLC-MS/MS法測定血漿中克拉霉素的批內(nèi)和批間精密度n=18

2．6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)(相對(duì)回收率) 取1．5 m l EP試管數(shù)支，按“2．4血漿中克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)制備含克拉霉素濃度分別為25、400、2500 ng/ml的含藥血漿，按“3血漿樣品分析方法”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，計(jì)算克拉霉素峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，將比值f代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算實(shí)測濃度與加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度(相對(duì)回收率)。血漿中低、中、高3個(gè)濃度克拉霉素的提取回收率分別為(94．1±8．00)%、(99．6 ±8．20)%、(97．3 ±4．70)%，平均提取回收率為(97．0 ±6．97)%。

2．7 樣品穩(wěn)定性考察 分別考察:克拉霉素血樣處理后的檢測樣品進(jìn)樣器中放置4 h穩(wěn)定性;血漿樣品室溫放置4 h穩(wěn)定性;血漿樣品－40℃反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性;血漿樣品－40℃凍存1個(gè)月后穩(wěn)定性。即制備低、中、高(25、400、2 500 ng/m l)3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)方法的每個(gè)濃度個(gè)3份，按“1．3血漿樣品分析方法”項(xiàng)下操作，每個(gè)方法最后所得上清液作為對(duì)應(yīng)0 h的檢測樣品溶液，立即取5μl進(jìn)樣分析，按照當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的濃度，計(jì)算各樣品的測得值與實(shí)際值的相對(duì)偏差(RE%)，與0 h的相應(yīng)濃度的樣品比較。見表2。

3 討論

HPLC-MS/MS法具有選擇性好、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于檢測生物樣本中的藥物以及藥代動(dòng)力學(xué)等研究，而基質(zhì)效應(yīng)則是此法測定生物樣本中藥物濃度時(shí)十分重要的問題，完整的方法確證應(yīng)包括對(duì)于方法基質(zhì)效應(yīng)的研究。采用梯度洗脫的色譜分離方法分析測定時(shí)間過于長，影響了方法的測定效率［6－8］。Cherlet指出使用高比例有機(jī)相進(jìn)行洗脫［7］，雖然克拉霉素能較快洗脫出峰，但同時(shí)也受到快速洗脫出的基質(zhì)對(duì)其離子化的影響。

本研究建立了測定人血漿中克拉霉素的HPLC-MS/MS法，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法確證，沉淀蛋白前處理方法簡單快速，優(yōu)化后的色譜條件極大縮短檢測時(shí)間，同時(shí)也減少了沉淀蛋白后生物樣本中基質(zhì)對(duì)克拉霉素的影響，實(shí)現(xiàn)了高通量測定，本方法靈敏度高，血漿用量僅為50μl，定量下限為10 ng/ml，能夠滿足克拉霉素的人體藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。

表2 各種貯存條件下血漿中克拉霉素穩(wěn)定性試驗(yàn) n=3

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