錢(qián)琴芳, James E. Kirby

美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系,馬塞諸塞州02215

真菌的快速檢測(cè)及鑒定之所以日益重要主要有以下原因:①免疫妥協(xié)的高?；颊咧饾u增多;②致病性真菌譜擴(kuò)大;③重要的醫(yī)學(xué)真菌對(duì)抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性。本文主要對(duì)真菌實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行綜述,通過(guò)對(duì)真菌病的診斷進(jìn)行分析,著重闡述應(yīng)用于現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室中有助于早期診斷及經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療的實(shí)驗(yàn)方法。

1 直接鏡檢法

臨床標(biāo)本的直接鏡檢方法簡(jiǎn)便、成本低廉,一直是真菌檢測(cè)的首選步驟。其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)快速且能為鑒定致病真菌類(lèi)型提供最初線索,有時(shí)對(duì)形態(tài)特別的致病真菌甚至可以直接進(jìn)行判定。正如革蘭染色是檢測(cè)臨床標(biāo)本中細(xì)菌感染時(shí)廣泛使用的鑒別染色法一樣,不同類(lèi)型的真菌有不同的染色特征,使得真菌酵母相和菌絲相的形態(tài)都可以被觀察到。如假絲酵母(下稱(chēng)念珠菌)屬染色效果極佳,但雙相型真菌染色結(jié)果不確定。通過(guò)使用氫氧化鉀及卡爾科弗盧爾熒光增白劑,真菌檢測(cè)有了進(jìn)一步的改善。前者可以消化周?chē)M織使真菌形態(tài)更明顯,后者與真菌細(xì)胞壁上的多糖特異性結(jié)合從而增加檢測(cè)的靈敏度和特異度。當(dāng)患者發(fā)生接合菌感染時(shí),因其進(jìn)展迅速,常需要及時(shí)手術(shù)治療以保全患者性命及四肢,此時(shí)應(yīng)用氫氧化鉀及卡爾科弗盧爾熒光增白劑對(duì)快速檢測(cè)可能的致病真菌類(lèi)型,如接合菌綱的毛霉菌屬等具有極大的意義。還有很多種真菌根據(jù)其在組織內(nèi)的不同形態(tài)特點(diǎn)可以很容易地用這種染色方法進(jìn)行鑒別,如馬爾尼菲青霉、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌及申克孢子絲菌等雙相型真菌,這些真菌通常生長(zhǎng)緩慢,且因形態(tài)不具特異性,需要復(fù)雜的培養(yǎng)鑒定過(guò)程。如馬爾尼菲青霉的鑒定需要通過(guò)特殊的培養(yǎng)技術(shù)使其轉(zhuǎn)化至酵母相,因?yàn)槿鄙籴槍?duì)這種雙相型真菌的分子探針和抗原檢測(cè)方法。因此使用氫氧化鉀和卡爾科弗盧爾熒光增白劑對(duì)組織中的真菌直接進(jìn)行形態(tài)學(xué)方面的鑒定極大地有助于快速診斷。

臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)于呼吸道標(biāo)本中肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii)診斷鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)始終是直接熒光共軛單克隆抗體(direct fluorescent-conjugated monoclonal antibody,DFA)檢測(cè)法。雖然某些聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法具有較高的靈敏度,但DFA檢測(cè)法對(duì)于某些標(biāo)本的檢測(cè)仍具有極佳的靈敏度和特異度。對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)陽(yáng)性患者誘導(dǎo)痰的檢測(cè),DFA檢測(cè)法和PCR的靈敏度可分別達(dá)到82%和95%。PCR對(duì)誘導(dǎo)痰檢測(cè)的特異度為94%,較DFA檢測(cè)法略低是因?yàn)檎Ｈ丝赡艽嬖谏倭康亩ㄖ簿?而傳統(tǒng)的DFA檢測(cè)法檢測(cè)不到。用DFA檢測(cè)法作為診斷金標(biāo)準(zhǔn),則PCR對(duì)HIV陽(yáng)性患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage,BAL)檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為100%和98%。值得注意的是,在器官移植患者中微生物的含量通常較低,可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,尤其是誘導(dǎo)痰標(biāo)本。

最近,Wang等回顧性地研究了DFA檢測(cè)法最適用的診斷方法。在一所市級(jí)三級(jí)醫(yī)療教學(xué)醫(yī)院,發(fā)現(xiàn)重復(fù)檢測(cè)肺孢子菌誘導(dǎo)痰標(biāo)本并不能顯著提高診斷率。而且,在HIV陰性患者中誘導(dǎo)痰的檢測(cè)對(duì)診斷并不敏感。于是他們推薦在HIV陰性患者中,最初應(yīng)采用BAL檢測(cè)法;而在HIV陽(yáng)性患者中,當(dāng)首次誘導(dǎo)痰檢測(cè)結(jié)果陰性后再采用BAL檢測(cè)法。相反,Pagano等在一項(xiàng)關(guān)于患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的HIV陽(yáng)性患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn),18例患者中有9例誘導(dǎo)痰標(biāo)本檢測(cè)出病原體。LaRocque 等也報(bào)道156份首次誘導(dǎo)痰檢測(cè)標(biāo)本中6份陽(yáng)性,以及20份重復(fù)誘導(dǎo)痰檢測(cè)中2份陽(yáng)性,并指出誘導(dǎo)痰檢測(cè)法可作為HIV陰性患者卡氏肺孢子菌檢測(cè)的首選方法。我們不清楚為什么這2個(gè)研究小組比Wang的小組對(duì)肺孢子菌檢出率更高?？赡艿脑虬?帶有較高量病原體人群的預(yù)篩選,在疾病不同階段的檢測(cè),檢測(cè)方法或操作的差異,以及誘導(dǎo)痰標(biāo)本收集技術(shù)的不同等。盡管文獻(xiàn)中推薦首選的樣本檢測(cè)方法有所不同,但DFA檢測(cè)法作為卡氏肺孢子菌快速診斷方法的價(jià)值是顯而易見(jiàn)的,并有可能用下述的輔助技術(shù)來(lái)補(bǔ)充完善。

2 臨床標(biāo)本真菌抗原的檢測(cè)

對(duì)于臨床標(biāo)本中某一特定真菌或某一類(lèi)真菌抗原的快速檢測(cè)有很多方法,舉例如下。

2.1 隱球菌抗原

在臨床實(shí)驗(yàn)室中,乳膠凝集實(shí)驗(yàn)已被廣泛應(yīng)用于血清及腦脊液中的新生隱球菌莢膜多糖抗原的檢測(cè)。這是一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法,與常規(guī)的印度墨汁染色檢測(cè)隱球菌莢膜方法比較,具有較高的靈敏度和特異度,因此很多臨床實(shí)驗(yàn)室已不再使用傳統(tǒng)的印度墨汁染色法進(jìn)行隱球菌的檢測(cè)。但是在某些播散性毛孢子菌屬感染和嗜二氧化碳菌敗血癥的患者中,偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。如當(dāng)腦脊液中隱球菌莢膜抗原水平較高時(shí),由于前帶效應(yīng)有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。該抗原檢測(cè)法的優(yōu)勢(shì)還在于其為定量檢測(cè)。比較典型的方法是,對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)稀釋建立濃度梯度(最大稀釋法),使其能夠檢測(cè)并反映出抗原的水平及患者的帶菌量。連續(xù)濃度梯度的建立對(duì)接下來(lái)的治療也有一定指導(dǎo)意義,但需要注意的是濃度并不精確,而且在某些治療成功的患者中,抗原并不一定能完全消失。對(duì)評(píng)估滴度的改變,用連續(xù)標(biāo)本的兩點(diǎn)比較法可以提高準(zhǔn)確性。滴度在4倍或4倍以上改變具有臨床意義。

2.2 念珠菌抗原

念珠菌屬仍然是引起系統(tǒng)性感染最常見(jiàn)的原因之一。相對(duì)于細(xì)菌敗血癥而言,念珠菌血癥具有死亡率高(49%)、住院時(shí)間長(zhǎng)、花費(fèi)大等特點(diǎn)。絕大多數(shù)念珠菌感染為白念珠菌和光滑念珠菌。檢出和最后鑒定菌種的平均時(shí)間,白念珠菌為35 h和86 h,光滑念珠菌為80 h和154 h。最近有研究表明,念珠菌血癥的延期治療極大增加了發(fā)病率和死亡率,因此急需對(duì)念珠菌的快速檢測(cè)方法。近來(lái),抗原檢測(cè)法也成為診斷危險(xiǎn)人群早期感染的一種方法。

甘露聚糖與β-葡聚糖同為念珠菌細(xì)胞壁的主要成分,被用于念珠菌感染的抗原檢測(cè)中。Platelia念珠菌抗原EIA(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室,美國(guó))使用一種單克隆抗體EB-CA1,去結(jié)合并檢測(cè)念珠菌屬的甘露糖戊醇抗原表位。該方法特異性極高,交叉反應(yīng)性很弱,僅可能與絲狀真菌如輪枝樣鐮刀菌和念珠地絲菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn),可檢測(cè)的甘露聚糖血癥與侵襲性念珠菌感染患者的念珠菌血癥有關(guān),表明該檢測(cè)法有臨床應(yīng)用價(jià)值。事實(shí)上,在真菌學(xué)檢測(cè)前的幾天到幾周就可以觀察到甘露聚糖血癥陽(yáng)性結(jié)果。該法對(duì)新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中念珠菌病的檢測(cè)和鑒定頗有優(yōu)勢(shì),敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為94.4%、94.2%、85%及98%。但該法對(duì)于一般患者的靈敏度較低,只有67%。在新生兒中靈敏度較高的原因推測(cè)可能有以下:①新生兒血循環(huán)中缺少抗甘露聚糖抗體;②血循環(huán)中外源凝集素濃度較低;③發(fā)生于新生兒的念珠菌病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)不同。需要注意的是,該法對(duì)某些種如近平滑念珠菌及克柔念珠菌的靈敏度較低,這些菌可能在成人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的概率更高,至少在器官移植患者疾病預(yù)防過(guò)程中,克柔念珠菌被發(fā)現(xiàn)的概率更高。以上在成人的研究是基于對(duì)α-連接甘露聚糖的檢測(cè)。但在對(duì)α-連接和β-連接2種甘露聚糖檢測(cè)的獨(dú)立研究中,發(fā)現(xiàn)該法在成人中的靈敏度接近90%,存在臨床應(yīng)用的可能。

2.3 馬爾尼菲青霉抗原

馬爾尼菲青霉是一種東南亞和中國(guó)特有的雙相型真菌,臨床上認(rèn)為可能是一種存在于免疫妥協(xié)患者體內(nèi)的條件致病真菌。由于培養(yǎng)時(shí)間及需轉(zhuǎn)化為酵母相才能診斷使馬爾尼菲青霉的培養(yǎng)較為困難。出于對(duì)快速鑒定的需要,人們開(kāi)發(fā)了一種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),即用特異的馬爾尼菲青霉甘露糖蛋白抗體檢測(cè)馬爾尼菲青霉抗原。一項(xiàng)臨床研究表明,該法可檢測(cè)出26例青霉病患者中的17例(65%)。另一種酶免疫測(cè)定法、斑點(diǎn)印跡ELISA及乳膠凝集實(shí)驗(yàn)可通過(guò)抗馬爾尼菲青霉的多克隆抗體(Mp1p)對(duì)尿液標(biāo)本中的馬爾尼菲青霉抗原進(jìn)行定量分析。在高危人群如艾滋病患者中,這些實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)的靈敏度分別為97%、94%和100%,特異度分別為98%、97%和99%。同樣,另一種ELISA使用源于原始培養(yǎng)過(guò)濾液的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的靈敏度為72%,特異度為100%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%,陰性預(yù)測(cè)值為97%。該法在18份經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)為陽(yáng)性的標(biāo)本中檢測(cè)出16份陽(yáng)性結(jié)果(89%)。與其他地區(qū)檢測(cè)雙相型真菌時(shí)采用抗原檢測(cè)法一樣,這些快速檢測(cè)法對(duì)于該地區(qū)青霉病的快速診斷極為有用。

2.4 組織胞漿菌抗原

據(jù)估計(jì),美國(guó)每年有500 000例新發(fā)組織胞漿菌感染的患者,這一雙相型真菌也被發(fā)現(xiàn)存在于包括中國(guó)在內(nèi)的世界各地。對(duì)體液中組織胞漿菌抗原的檢測(cè)較活檢和培養(yǎng)法更加有助于快速診斷。在播散性組織胞漿菌感染患者中,超過(guò)90%的患者尿中可檢測(cè)到組織胞漿菌抗原,血清中至少為75%。經(jīng)過(guò)治療后抗原水平逐漸下降,而復(fù)發(fā)時(shí)抗原濃度增加,這也是監(jiān)測(cè)治療的有用工具。在肺組織胞漿菌病患者BAL中也可能檢測(cè)出抗原。事實(shí)上,在肺組織胞漿菌病患者中(包括尿抗原陰性患者),BAL的抗原檢出率可達(dá)84%,提示對(duì)已具有肺部癥狀的患者,可能是一種首選的診斷方法。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者中,>50%的患者腦脊液中可檢測(cè)到組織胞漿菌抗原。在播散性感染時(shí)也可能在胸膜、心包、腹膜、滑液及眼內(nèi)液體中查到抗原。這也為特殊部位抗真菌用藥及療程的選擇提供了有利的診斷依據(jù)。

但是在感染其他雙相型真菌的患者中,由于交叉反應(yīng)的存在也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,這些雙相型真菌包括芽生菌等。據(jù)報(bào)道這一真菌存在于包括中國(guó)在內(nèi)的世界各地,并可引起人類(lèi)感染。在接受兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白抗免疫排斥的器官移植患者中,假陽(yáng)性率近16%。接受兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白的患者可產(chǎn)生異嗜性抗體,與早期抗原檢測(cè)法中的組織胞漿菌抗原交叉反應(yīng)。2004年,MiraVista Diagnostics(美國(guó))推出了第2代組織胞漿菌抗原EIA,提高了敏感度,減少了患者體內(nèi)異嗜性抗體的交叉反應(yīng)。因此,與臨床實(shí)驗(yàn)室的溝通非常重要,要了解患者是否應(yīng)用了抗胸腺細(xì)胞球蛋白,據(jù)此選擇特異的檢測(cè)方法?，F(xiàn)已出現(xiàn)第3代的定量EIA,測(cè)定范圍下限為0.3 ng/ml,報(bào)告范圍為0.6～39 ng/ml。這一新方法的靈敏度還不確定,但據(jù)推測(cè)應(yīng)較前2代更高。

2.5 半乳甘露聚糖

煙曲霉病是免疫妥協(xié)患者中最常見(jiàn)的侵襲性絲狀真菌感染,因其感染部位較深故應(yīng)用常規(guī)的培養(yǎng)技術(shù)很難做到及時(shí)檢測(cè)。而且,如何區(qū)分是真菌感染還是真菌定植較為關(guān)鍵,因?yàn)樵谶@類(lèi)患者中真菌定植也較為常見(jiàn)。尤其在選擇藥物如兩性霉素B進(jìn)行治療時(shí),對(duì)這類(lèi)同時(shí)患有多種疾病患者,藥物的毒性較大,因此未發(fā)生侵襲性真菌感染患者無(wú)需用藥。血液中真菌及真菌抗體的存在對(duì)侵襲性真菌感染診斷尤為特異,因此成為一項(xiàng)重要的診斷標(biāo)準(zhǔn)。血液中絲狀真菌的培養(yǎng)診斷不敏感,但曲霉抗原的檢測(cè)對(duì)診斷意義重大。

半乳甘露聚糖是一種大量存在于真菌胞壁的成分,對(duì)曲霉屬較特異,絕大多數(shù)臨床檢測(cè)曲霉抗原的方法都是基于對(duì)半乳甘露聚糖的檢測(cè)。美國(guó)食品與藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)最近批準(zhǔn)了檢測(cè)血清曲霉半乳甘露聚糖的Platelia曲霉抗原EIA(Bio-Rad),用于深部侵襲性曲霉感染的檢測(cè),應(yīng)用于不同患者群的臨床研究。值得注意的是,該檢測(cè)方法存在判定閾值的問(wèn)題。檢測(cè)結(jié)果用半乳甘露聚糖指數(shù)表示,指數(shù)大小取決于標(biāo)本吸光度/對(duì)照判定閾值的平均吸光度。在美國(guó)判定陽(yáng)性結(jié)果的指數(shù)為0.5,而在歐洲該指數(shù)為1.5,這就降低了靈敏度而增加了特異度。不同地區(qū)采用不同的陽(yáng)性結(jié)果判定閾值導(dǎo)致很難通過(guò)文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)果比較,但仍然存在一些普遍現(xiàn)象。如果判定閾值選擇1～1.5,則在化療及造血干細(xì)胞移植患者中,該法的靈敏度為67%～93%,特異度為86%～95%。而即使判定閾值選擇0.5,肺移植患者中該法的靈敏度仍低于前者(30%)。

雖然以前更普遍使用指數(shù)>1.0作為陽(yáng)性結(jié)果的判定閾值,但發(fā)現(xiàn)如果采用更低的指數(shù)將會(huì)更早檢測(cè)出是否患病。然而對(duì)于閾值0.5～0.9的陽(yáng)性標(biāo)本,再次檢測(cè)呈陽(yáng)性的只有87%;當(dāng)閾值較大時(shí)則有更好的可重復(fù)性。后來(lái),Maertens等考查了這一方法的特點(diǎn),要求連續(xù)獲得2次陽(yáng)性結(jié)果才可得出真正陽(yáng)性結(jié)論。他們發(fā)現(xiàn)選擇1.5作為判定閾值,則2次檢測(cè)陽(yáng)性的靈敏度為94%,特異度為99%;如果選擇0.5,則靈敏度可增加至96.5%,而特異度降低至98.6%。需要注意的是,該項(xiàng)研究中靈敏度較高可能是因?yàn)閷?duì)預(yù)檢測(cè)患病風(fēng)險(xiǎn)高的人具有檢測(cè)局限性。因此,進(jìn)行2次檢測(cè)成為確定陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)做法,尤其是在采用較低的判定閾值時(shí)。而且,重復(fù)實(shí)驗(yàn)還可減少由于樣本受其他真菌污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

值得注意的是,曲霉半乳甘露聚糖EIA實(shí)驗(yàn)也可與其他真菌的半乳甘露聚糖反應(yīng),包括青霉屬、毛癬屬、枝孢霉屬、支頂孢霉屬、鏈格孢霉屬、鐮刀菌屬、萬(wàn)吉拉霉屬、紅酵母屬及擬青霉屬。曲霉半乳甘露聚糖實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果可能有以下幾種原因。

(1) 患者有其他真菌感染。已有研究表明,該法有望用于東南亞包括中國(guó)特有的雙相型真菌馬爾尼菲青霉感染的早期診斷。在15份證實(shí)為青霉病的血清中,有11份通過(guò)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(判定閾值>0.5)。但如果可行的話,前述的特異性檢測(cè)馬爾尼菲青霉抗原的檢測(cè)法更佳。在1例肺隱球菌感染及隱球菌菌血癥的患者中就出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),新生隱球菌的乳木甘露聚糖與半乳甘露聚糖抗原起交叉反應(yīng)。

(2) 如果對(duì)用于半乳甘露聚糖檢測(cè)的血清樣本沒(méi)有進(jìn)行充分的無(wú)菌操作,也有可能造成真菌污染。所以推薦使用獨(dú)立的血液標(biāo)本存放管,而非一管多用,避免實(shí)驗(yàn)室的污染。

(3) 還有報(bào)道稱(chēng),使用抗生素如哌拉西林/他唑巴坦和阿莫西林-克拉維酸鉀的患者會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。哌拉西林源于青霉屬,而青霉屬胞壁中含有半乳甘露聚糖。在藥物生產(chǎn)過(guò)程中,半乳甘露聚糖的攜帶污染是產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的原因。

(4) 兒科患者出現(xiàn)假陽(yáng)性概率更大。研究表明,該現(xiàn)象可能與兒童及新生兒體內(nèi)能夠與半乳甘露聚糖抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌性抗原濃度較高有關(guān)。尤其是新生兒腸道內(nèi)存在大量的雙歧桿菌,而存在于該菌細(xì)胞壁上的脂膜酸導(dǎo)致了Platelia曲霉檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果。

在侵襲性感染的診斷上,抗原檢測(cè)是否優(yōu)于影像學(xué)檢測(cè)一直存在爭(zhēng)議。以前有研究表明,對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者,半乳甘露聚糖抗原血癥要比影像學(xué)及臨床癥狀出現(xiàn)早。但Weisser等發(fā)現(xiàn),在侵襲性肺曲霉病中半乳甘露聚糖檢測(cè)并不優(yōu)于肺部的計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)。因此,與單純進(jìn)行影像學(xué)檢查相比較,建議對(duì)存在真菌感染危險(xiǎn)的患者采用不同的檢測(cè)策略。

半乳甘露聚糖實(shí)驗(yàn)也可用于其他體液中曲霉抗原的檢測(cè)。BAL中半乳甘露聚糖的檢測(cè)對(duì)于診斷侵襲性肺曲霉病很有幫助。如在病程超過(guò)10 d的中性粒細(xì)胞減少的血液病患者和用氟康唑或伊曲康唑預(yù)防治療的人群中,對(duì)侵襲性曲霉感染的靈敏度在確診患者中為100%,在可能患者中為89%,在疑診患者中為42%。在該項(xiàng)小樣本研究中,特異度為100%。同樣,在器官移植患者中靈敏度為100%,特異度為84.2%。但Musher等在另一項(xiàng)規(guī)模更大的研究中發(fā)現(xiàn),該法對(duì)造血干細(xì)胞移植患者,靈敏度只有76%,特異度為94%?，F(xiàn)在人們重點(diǎn)關(guān)注的是對(duì)BAL檢測(cè)可能造成侵襲性感染的過(guò)度診斷,因?yàn)榉乔忠u性曲霉球的定植或存在可能導(dǎo)致假陽(yáng)性。所以,學(xué)者們推薦在檢測(cè)侵襲性感染時(shí)只使用血清標(biāo)本以增加特異度。

對(duì)特殊的解剖腔隙中液體檢測(cè)對(duì)于診斷感染的意義還不清楚,也無(wú)相關(guān)介紹。半乳甘露聚糖抗原血癥患者腦脊液中可檢測(cè)到半乳甘露聚糖,但在沒(méi)有明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的情況下,鞘內(nèi)半乳甘露聚糖抗原的出現(xiàn)可能與腰穿時(shí)血液中半乳甘露聚糖進(jìn)入鞘內(nèi)造成腦脊液污染或者半乳甘露聚糖通過(guò)血-腦屏障滲透入腦脊液有關(guān)。在其他組織和體液中,半乳甘露聚糖檢測(cè)的準(zhǔn)確性還不清楚。

2.6 β-D-葡聚糖

(1,3) β-D-葡聚糖〔(1,3) β-D-glucan,BDG〕診斷方法的建立是潛在真菌感染檢測(cè)方法的重大進(jìn)步。BDG是存在于絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的多糖類(lèi)組分。接合菌中(如毛霉和根霉)不含BDG,隱球菌中含量極低。2004年美國(guó)FDA批準(zhǔn)Fungitell(Associates of Cape Cod)作為一種BDG的生色測(cè)定法用于真菌感染診斷。該法快速、簡(jiǎn)單、直接。其原理與鱟變形細(xì)胞檢測(cè)內(nèi)毒素的原理相似。鱟血液中的凝血因子對(duì)BDG和內(nèi)毒素的激活作用極其敏感。BDG和內(nèi)毒素分別激活凝血酶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中的不同分支,這些不同分支最終匯合到最終的共同途徑并導(dǎo)致血凝凝固。在Fungitell檢測(cè)法中,BDG特異性因子和共性因子純化后可用于BDG敏感且特異的檢驗(yàn)。

血清樣本中BDG的檢測(cè)已用于系統(tǒng)性真菌感染的診斷。正常人血清中存在低濃度的BDG,通常為10～40 pg/ml,濃度>80 pg/ml定義為結(jié)果陽(yáng)性。BDG水平不斷升高意味著侵襲性曲霉病的病情進(jìn)展,而降低則與治療有關(guān)。BDG用于診斷侵襲性曲霉病的靈敏度為80%,特異度為81%。該法總的靈敏度60%～100%,特異度為64%～99%。BDG水平升高也可能與念珠菌感染相關(guān)。在肺孢子菌感染患者中也可觀察到高水平的BDG,因此該方法可與相應(yīng)的影像學(xué)共同用于肺孢子菌性肺炎的診斷。但由于該實(shí)驗(yàn)所用的試劑原料鱟的供應(yīng)量不足,其應(yīng)用受限。但重組DNA技術(shù)無(wú)疑能取代這一原始的制備過(guò)程,使應(yīng)用更廣泛,費(fèi)用更低廉。需要指出的是,該方法會(huì)出現(xiàn)一些特別的假陽(yáng)性反應(yīng)。如在血液制品過(guò)濾器和血液透析膜中的纖維素污染可能導(dǎo)致BDG升高的假陽(yáng)性結(jié)果。細(xì)菌血癥也偶爾會(huì)引起假陽(yáng)性結(jié)果,但原因還不清楚。

3 血清樣本中真菌抗體的檢測(cè)

對(duì)患者血清中特異性抗體的檢測(cè)在很久以前就用于雙相型真菌感染的輔助診斷,這些雙相型真菌包括莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌及巴西副球孢子菌。莢膜組織胞漿菌和皮炎芽生菌發(fā)現(xiàn)于中國(guó),可引起人類(lèi)感染,因此這些檢測(cè)方法在中國(guó)的醫(yī)療實(shí)踐中非常有用。

馬爾尼菲青霉是一種東南亞和中國(guó)特有的雙相型真菌。在過(guò)去10年中有很多關(guān)于馬爾尼菲青霉血清學(xué)檢測(cè)方法的評(píng)估研究,如免疫擴(kuò)散、間接熒光抗體技術(shù)和免疫印跡等。馬爾尼菲青霉酵母相抗原檢測(cè)法比菌絲相抗原檢測(cè)法靈敏度更高。這一現(xiàn)象并不奇怪,因?yàn)槿梭w內(nèi)存在的馬爾尼菲青霉為酵母相,因此成為抗體靶點(diǎn)的可能性更大。人們發(fā)現(xiàn)61 000、54 000、50 000、38 000酵母相蛋白有望成為基因重組體的靶點(diǎn)。一項(xiàng)研究表明,馬爾尼菲青霉感染患者血清中,86%與61 000抗原反應(yīng),71%與54 000抗原反應(yīng),48%與50 000抗原反應(yīng)。但這些實(shí)驗(yàn)或者臨床樣本量較小或者靈敏度較低。用38 000抗原進(jìn)行免疫印跡時(shí),感染隱球菌或念珠菌的HIV陽(yáng)性患者中有25%(17/67)呈弱陽(yáng)性反應(yīng),在無(wú)癥狀HIV陽(yáng)性患者中為17%(45/262)。因?yàn)檫@些患者來(lái)自某一特定病區(qū),所以他們是否以前就存在感染或亞臨床感染,或者是否為非特異性反應(yīng)都不清楚。因此,這些血清學(xué)方法的應(yīng)用特點(diǎn)還值得進(jìn)一步研究。最近,有人開(kāi)發(fā)出抗重組馬爾尼菲青霉甘露糖蛋白抗體的ELISA檢測(cè)方法,顯示了良好的應(yīng)用前景,靈敏度達(dá)80%,特異度達(dá)100%。

4 培養(yǎng)法檢測(cè)真菌及其表型鑒定

目前,尚沒(méi)有針對(duì)真菌血培養(yǎng)的正式指南。但是,一般認(rèn)為血培養(yǎng)絲狀真菌的檢出率非常低,這與真菌雖以系統(tǒng)感染為主卻更易從其他組織分離得到有關(guān)。人工溶解離心試管法(Isolator,Wampole Laboratories,美國(guó))是最早用于真菌血培養(yǎng)的方法之一,但需大量人力資源且容易污染。自動(dòng)化真菌血培養(yǎng)系統(tǒng),如BACTEC Myco/F Lytic血培養(yǎng)(Becton Dickinson,美國(guó))已經(jīng)上市,但其培養(yǎng)瓶的價(jià)格較人工法要昂貴得多。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血培養(yǎng)需5 d,自動(dòng)培養(yǎng)需6周,所以比較費(fèi)時(shí)。特別是最近研究表明,大量等同于標(biāo)準(zhǔn)血培養(yǎng)的臨床標(biāo)本(需氧和厭氧的)以及Myco/F Lytic培養(yǎng)可用于鑒定包括念珠菌屬和新生隱球菌在內(nèi)的酵母。因此,分離管檢測(cè)法和商品化的真菌血培養(yǎng)瓶檢測(cè)法應(yīng)該用于較難培養(yǎng)的真菌如莢膜組織胞漿菌,而無(wú)需用于包括酵母屬和新生隱球菌等在內(nèi)的常見(jiàn)酵母。由于在這些研究中較少涉及雙相真菌和絲狀真菌感染的鑒定,因此進(jìn)一步研究將有助于確定目前所采用的及新型真菌血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)這些病原真菌的有效性。

幾種快速測(cè)定物種形成的方法可用來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的真菌,包括芽管實(shí)驗(yàn)、海藻糖同化實(shí)驗(yàn)和PNA-FISH。芽管實(shí)驗(yàn)是用來(lái)推斷鑒定白念珠菌的一種簡(jiǎn)單方法,雖然不能區(qū)分白念珠菌與極少分離到的都柏林念珠菌,但因其簡(jiǎn)單、便宜,仍被廣泛應(yīng)用于推斷性鑒定從有菌物質(zhì)中分離出的白念珠菌。從有菌物質(zhì)中明確鑒定出白念珠菌并不可行,因?yàn)檫@兩種物種對(duì)抗真菌試劑都同樣敏感。海藻糖同化實(shí)驗(yàn)是快速推斷性鑒定光滑念珠菌的另外一種方法(3 h內(nèi))。光滑念珠菌是從血液感染中分離出的第2種常見(jiàn)的酵母。

人工和自動(dòng)化生化檢測(cè)板都可用于真菌臨床分離株的鑒定。傳統(tǒng)的人工API 20C AUX酵母鑒定板耗費(fèi)人力,某些菌種的鑒定需72 h。而自動(dòng)酵母鑒定系統(tǒng)不僅節(jié)約體力,且所需周轉(zhuǎn)時(shí)間較短。如微生物生化自動(dòng)分析系統(tǒng)(VITEK 2)需18 h,顯微掃描系統(tǒng)(MicroScan)僅需4 h。臨床實(shí)驗(yàn)室中使用VITEK 2自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)(BioMerieux,法國(guó))的ID-YST卡鑒定常見(jiàn)酵母分離株的效果非常明確。早期的VITEK 2 ID-YST卡在鑒定包括都柏林念珠菌、C.inconspicua、挪威念珠菌及隱球菌在內(nèi)的一些菌種方面還存在一些問(wèn)題。但一種替代熒光VITEK YST的新型VITEK YST比色卡能較好檢測(cè)出這些病原真菌,且重復(fù)性好。該法可準(zhǔn)確鑒定98.2%～98.5%臨床分離株,僅有1.0%的假陽(yáng)性及0.5%未能檢測(cè)。低識(shí)別率從API法的30.0%降至YST法的18.9%,且只需更少的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)或補(bǔ)充檢測(cè)。但對(duì)C.inconspicua、克柔念珠菌、郎比可念珠菌及頭地霉,YST和API的鑒定率還是很低。因?yàn)檫@些菌常為惰性菌且所需的碳源譜非常相似,而且很少能從臨床樣本中分離獲得。不過(guò),YST在對(duì)隱球菌屬的鑒定方面已有明確的改進(jìn)。

諸如CHROMagar和Oxoid BrillianceTM之類(lèi)的念珠菌呈色瓊脂已被廣泛應(yīng)用于念珠菌屬的鑒定,通過(guò)原培養(yǎng)基顏色的改變來(lái)鑒定菌種。這種培養(yǎng)基融合了產(chǎn)色物質(zhì),經(jīng)不同的菌種代謝后可產(chǎn)生不同種的特定顏色。這使得念珠菌屬某些菌種的快速鑒定成為可能,并避免由于混合感染所形成的菌落形態(tài)難以區(qū)分所導(dǎo)致的漏檢。由于其具有高特異度(可達(dá)100%),對(duì)白念珠菌/都柏林念珠菌、熱帶念珠菌及克柔念珠菌有很好的鑒定效果。

5 分子生物學(xué)檢測(cè)法在檢測(cè)和鑒定臨床標(biāo)本、培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的應(yīng)用

念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性相對(duì)穩(wěn)定。因此,美國(guó)傳染病協(xié)會(huì)指南推薦根據(jù)菌種鑒定結(jié)果選擇早期抗真菌治療方案。在合適的藥敏試驗(yàn)出現(xiàn)之前,念珠菌的快速鑒定非常關(guān)鍵,可以指導(dǎo)抗真菌藥物的選擇。因此,盡可能早地對(duì)病原真菌作出鑒定很重要。未經(jīng)FDA批準(zhǔn)的一些分子檢測(cè)方法同樣可對(duì)樣本中的真菌做直接檢測(cè)。然而,最近發(fā)現(xiàn)PNA-FISH對(duì)鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性的白念珠菌和(或)光滑念珠菌非?？煽?靈敏度和特異度分別達(dá)99%～100%和100%。2008年一種新的PNA-FISH檢測(cè)法被FDA批準(zhǔn),用來(lái)快速檢測(cè)和鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性的白念珠菌/近平滑念珠菌、熱帶念珠菌及光滑念珠菌/克柔念珠菌,將可能對(duì)氟康唑敏感或耐藥的菌種區(qū)分開(kāi)來(lái)。多元串聯(lián)式PCR也已用來(lái)鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性的念珠菌及其他真菌,有高度特異度和靈敏度,檢測(cè)限為每毫升血10 CFU。該方法具有簡(jiǎn)單、特異性好、價(jià)廉以及自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),非常適合無(wú)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)者操作。從DNA提取到PCR分析,整個(gè)過(guò)程不超過(guò)4 h。另外,使用物種特異性探針的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)和對(duì)直接來(lái)源于陽(yáng)性血培養(yǎng)基的物種基因擴(kuò)增后解鏈溫度的分析,與檢測(cè)金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的商品化方法相似,可能會(huì)使這種分析更為直接。另一種用來(lái)鑒定臨床呼吸系統(tǒng)樣本中曲霉和念珠菌的實(shí)時(shí)PCR法可作為早期診斷這些真菌感染的潛在手段。

分子生物學(xué)方法已應(yīng)用到臨床培養(yǎng)標(biāo)本和組織病理切片中分離所得的雙相真菌的明確鑒定。近年來(lái),商品化的莢膜組織胞漿菌、球孢子菌以及皮炎芽生菌的DNA探針已獲FDA批準(zhǔn)上市并被廣泛使用?；诖说碾s交法有很高的靈敏度(98%～100%)和特異度(98%～100%),2 h內(nèi)可獲結(jié)果。僅金孢子菌屬和黑曲霉會(huì)有較少見(jiàn)的假陽(yáng)性;但菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征可避免識(shí)別錯(cuò)誤。有趣的是,當(dāng)組織病理顯示有組織胞漿菌感染時(shí),AccuProbe也可對(duì)組織標(biāo)本上存在的該菌快速檢測(cè)。有研究使用該方法成功鑒定出離體雄鹿瓣膜組織上存在的組織胞漿菌。此外,18S和28S rRNA探針已被研制出來(lái)鑒定上述的雙相真菌和申克孢子絲菌。雖然針對(duì)這些病原體,Grocott Methenamine銀染法的靈敏度要高出10%,但原位雜交法的特異度可達(dá)100%并可輔助鑒定在較罕見(jiàn)組織中形成的不具有診斷性形態(tài)特征菌種。因此,該類(lèi)分子診斷手法將有可能輔助診斷疑難病例。

現(xiàn)已有數(shù)種分子生物學(xué)方法可用來(lái)鑒定馬爾尼菲青霉培養(yǎng)株或直接來(lái)自臨床的標(biāo)本。目前,已有針對(duì)臨床馬爾尼菲青霉培養(yǎng)株快速檢測(cè)的單式和套式PCR檢測(cè)法,采用該菌的特異性18S rRNA基因序列作為探針。這些方法的檢測(cè)限分別為1.0 pg/μl純化DNA及1.8 fg/μl純化DNA。另一種基于馬爾尼菲青霉18S rRNA基因序列的半套式PCR法可用于檢測(cè)純培養(yǎng)物和臨床上確診馬爾尼菲青霉感染的臨床病例標(biāo)本。最近,一種以5.8S rRNA基因序列作為引物的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法已投入使用,用于血培養(yǎng)和直接來(lái)自外周血中的以及血培養(yǎng)陽(yáng)性的馬爾尼菲青霉菌的鑒定。檢測(cè)限為每毫升血10個(gè)酵母細(xì)胞。這些PCR法對(duì)疾病早期診斷的作用仍有待臨床應(yīng)用來(lái)證實(shí),希望能同其他病原真菌鑒定的分子診斷技術(shù)一樣,在未來(lái)得到更多的應(yīng)用。

PCR法對(duì)侵襲性曲霉感染的全血、血清、BAL及活檢組織等標(biāo)本的檢測(cè)均有效。該法與曲霉半乳甘露聚糖檢測(cè)法及在歐洲上市的實(shí)時(shí)PCR法有同樣功效。在需要檢測(cè)的血清標(biāo)本量較大時(shí)(1 ml),PCR法比半乳甘露聚糖法更敏感。而且,這種實(shí)時(shí)PCR法中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)半乳甘露聚糖法中存在的交叉反應(yīng),分析特異度可達(dá)100%。

PCR聯(lián)合DNA測(cè)序是目前新興的臨床菌種和真菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的診斷方法。MicroSeq D2 28S rRNA基因真菌序列試劑盒(Applied Biosystems)已經(jīng)上市,包括PCR和序列反應(yīng)劑、軟件及真菌序列庫(kù)。但該試劑盒并未獲FDA批準(zhǔn),目前僅在美國(guó)注冊(cè)作為研究用,可對(duì)絲狀真菌和酵母的臨床株作出精確診斷。然而,基因庫(kù)中缺乏相關(guān)序列導(dǎo)致皮膚絲狀真菌的鑒定受到限制。ViroDec(Roche Diagnostics)是一種基于網(wǎng)頁(yè)瀏覽的序列分析軟件,可作為MicroSeq真菌鑒定序列庫(kù)的替代數(shù)據(jù)庫(kù)。

多元探針檢測(cè)法有望成為檢測(cè)方法之一。最近一項(xiàng)研究報(bào)道一種基于DNA微陣列的系統(tǒng)檢測(cè)法,可檢測(cè)從臨床樣本中分離的多種常見(jiàn)病原真菌,包括念珠菌、新生隱球菌、曲霉、皮膚癬菌、鐮孢霉和馬爾尼菲青霉。該研究采用通用的真菌探針I(yè)TS1和ITS4來(lái)擴(kuò)增非編碼ITS區(qū)域(ITS1和ITS2)和ITS區(qū)域間的5.8S rRNA基因,盡管僅涉及少量臨床株,該方法鑒定菌株到屬的特異度達(dá)100%,到種的特異度達(dá)85%。但該研究沒(méi)有涉及馬爾尼菲青霉臨床株的檢測(cè),還必須要對(duì)該法在臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用做進(jìn)一步評(píng)價(jià)?，F(xiàn)已有液態(tài)芯片探針檢測(cè)法的報(bào)道,由于其已應(yīng)用到呼吸道病毒的診斷,故很可能成功應(yīng)用于臨床真菌的檢測(cè)。

6 結(jié)語(yǔ)

到目前為止,已有很多快速檢測(cè)方法應(yīng)用于真菌感染的早期輔助診斷,包括臨床標(biāo)本抗原檢測(cè)、快速培養(yǎng)檢測(cè)法以及分子診斷檢測(cè)法等。隨著該領(lǐng)域的快速發(fā)展,對(duì)不同檢測(cè)方法優(yōu)劣的研究探討也在不斷進(jìn)行中,可以得出以下結(jié)論和預(yù)期。

首先,簡(jiǎn)便的抗原檢測(cè)法將被廣泛采用,因設(shè)備及人員投入較少且檢測(cè)迅速。但該法也有特定的臨床適用條件。如在適當(dāng)?shù)牡乩韰^(qū)域和一定的患病人群中,馬爾尼菲青霉的抗原檢測(cè)可快速確診并指導(dǎo)臨床醫(yī)生采取恰當(dāng)?shù)闹委煷胧Ｔ摲ㄉ踔量砂l(fā)展為卡片形式的側(cè)流夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)法,使其在診所進(jìn)行檢測(cè)成為可能,這也與最近采用的瘧疾快速診斷法相類(lèi)似。

其次,分子診斷學(xué)領(lǐng)域有了迅速的進(jìn)展。自動(dòng)抽提和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的發(fā)展將促進(jìn)更健全的分子診斷技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷。分子檢測(cè)技術(shù)費(fèi)用的降低使分子診斷技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在資源匱乏的地區(qū)也能得以展現(xiàn)。一旦投資成立一個(gè)分子診斷實(shí)驗(yàn)室,就可開(kāi)展大量不同的檢測(cè)真菌或非真菌類(lèi)病原體的檢測(cè)方法。因此,分子診斷技術(shù)將在真菌感染診斷中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。這項(xiàng)進(jìn)步會(huì)影響診斷法的多個(gè)方面,如臨床真菌樣本的直接檢測(cè)(血液中侵襲性曲霉的檢測(cè))將由于其診斷特異性而最終取代抗原檢測(cè)法。此外,分子診斷技術(shù)使快速鑒定培養(yǎng)物成為可能,而當(dāng)前由專(zhuān)家對(duì)真菌菌落和鏡下形態(tài)作出經(jīng)驗(yàn)性的判斷費(fèi)力且耗時(shí)。

總之,本綜述所涉及的診斷方法進(jìn)展將使真菌疾病診斷更加快速、特異,為患者帶來(lái)福音。