王亞琳,張湘燕,王壓娣,車小燕,郭曉奎

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,上海 200025; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所,廣州 510282

鉤端螺旋體(簡稱鉤體)屬螺旋體目、鉤端螺旋體科、鉤端螺旋體屬。鉤體呈細(xì)長絲狀、圓柱螺旋形。侵入人體以黏膜和皮膚途徑最為常見[1]。致病性鉤體至少可分為16個基因種、25個血清群、260多個血清型,可引起鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)。鉤體病是世界范圍內(nèi)流行最廣泛的人畜共患病之一,動物宿主達(dá)200余種,是潛在的世界性公共衛(wèi)生問題,我國在1953年已將其列為乙類法定傳染病。2003年,我國完成第1株致病性鉤體的基因組測序工作[2]。到目前為止,完成測序的鉤體株已有6株,為鉤體的各項研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

鉤體病的臨床癥狀多變,極易與其他疾病混淆[3],故早期實驗室診斷對于有效治療、監(jiān)控鉤體病具有十分重要的作用。鉤體病血清學(xué)診斷方法包括顯微凝集試驗(microscopic agglutination test,MAT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等,用于檢測患者血清中針對鉤體的特異抗體水平,但不能很好區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染。檢測鉤體抗原的方法,如培養(yǎng)法因耗時長且靈敏度低而不宜用于早期快速診斷;核酸檢測法,如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等對實驗儀器要求高,且特異性低,存在較高的假陽性。

LipL32是迄今為止已知的鉤體外膜中含量最豐富的暴露蛋白,是致病性鉤體的保守蛋白,有很好的免疫原性,被認(rèn)為是最好的診斷抗原之一,靈敏度和特異度均可達(dá)到90%以上[4]。本實驗嘗試制備LipL32的單克隆抗體并篩選出其中可用于檢測的,以期能克服現(xiàn)有鉤體抗原檢測中靈敏度和特異度較低等缺點,為快速、準(zhǔn)確地檢測鉤體抗原提供可能。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用在中國流行的15株致病性鉤體株及1株腐生型株(表1),均來源于中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制研究所。EMJH培養(yǎng)基參照參考文獻(xiàn)[3]配置;RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine surum,FBS)、DMEM培養(yǎng)基、慶大霉素購自Gibco公司,十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)購自TaKaRa公司,福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、50%聚乙二醇1450(polyethylene glycol 1450,PEG1450)、HAT營養(yǎng)選擇培養(yǎng)基〔含次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)〕、HT營養(yǎng)選擇培養(yǎng)基購自Sigma Aldrich公司,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG和IgM購自Sigma公司,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3購自Zymed公司,生物素購自Pierce公司,HRP標(biāo)記的親和素購自BioLegend公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,NTA樹脂購自上海申能博彩公司,ELISA底物A、B液購自上海晶美公司,酶標(biāo)板購自康寧公司。SPF級BALB/c小鼠和NS-1細(xì)胞株購自第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

表1中國流行的15株致病性鉤體及1株非致病性鉤體的血清群、血清型、菌株及菌號

Tab.1Fifteendominantpathogenicstrainsandonenon-pathogenicstrainofLeptospirainChina

*,the strain number of National Institute for the Control of Pharmaceu-tical and Biological Products;**, non-pathogenicLeptospirastrain.

1.2 方法

1.2.1 免疫原與檢測原的制備

1.2.1.1鉤體外膜蛋白的分離[5]用EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)黃疸出血群賴株鉤體至1×108條/ml后,4 ℃ 8 000g離心30 min;用等培養(yǎng)體積的磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)(含5 mmol/L MgCl2)4 ℃ 8 000g,洗2次;然后加入1/20培養(yǎng)體積于4 ℃預(yù)冷的1% Triton X-114〔含150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA〕冰浴30 min,17 000g離心10 min;取上清液,加入20 mmol/L CaCl2,37 ℃孵育10 min,1 500g室溫離心10 min。有機(jī)相用4 ℃預(yù)冷的丙酮沉淀過夜,次日8 000g離心10 min,沉淀為外膜成分。

1.2.1.2非變性條件下LipL32重組蛋白的表達(dá)LipL32重組蛋白以問號鉤體黃疸出血群賴株的基因組為模板,表達(dá)載體為Pet28b,表達(dá)菌株為大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21。用1 mmol/L IPTG 22 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h,收集菌體。用1/20細(xì)菌生長體積的NTA-0〔20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.9)、0.5 mol/L NaCl、10% glycerol〕和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)懸浮細(xì)胞,加0.4 mg/ml溶菌酶裂解,然后加0.05% Triton X-100,充分混勻;冰上放置30 min,間或混勻,冰上超聲破碎。20 000g,4 ℃離心20 min,取上清液與NTA-0平衡好的NTA樹脂混合,4 ℃過夜。次日加入層析柱中,用含0、20、40、60、80、100、200、500 mmol/L咪唑的NTA-0溶液梯度洗脫,收集洗脫液,經(jīng)蛋白電泳和免疫印跡法鑒定洗脫液中是否含純的LipL32重組蛋白。將該洗脫液用0.01 mol/L PBS透析、濃縮,考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度。

1.2.2 單克隆抗體的制備

1.2.2.1動物免疫BALB/c小鼠,雌性,4～6周齡,分2組,每組3只。第1組用LipL32重組蛋白免疫,每次50 μg/只。第2組用LipL32重組蛋白與抽提的外膜蛋白交替免疫,每次50 μg/只。第1次采用福氏完全佐劑,與蛋白液等體積混勻,后3次免疫采用福氏不完全佐劑,每2周免疫1次。測定小鼠血清效價,分別選取2組中免疫效果最佳者于融合前3 d用LipL32重組蛋白腹腔脾內(nèi)注射加強(qiáng)免疫(100 μg)。

觀察患者的心絞痛發(fā)作情況(發(fā)病次數(shù)及時間),記錄治療前、后24 h動態(tài)心電圖情況,結(jié)合冠心病心絞痛療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療效果評價[3],統(tǒng)計兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率。

1.2.2.2抗體效價測定免疫4次后,經(jīng)尾靜脈采血測定血清中抗體效價。取LipL32重組蛋白,鉤體56601株全菌超聲裂解上清液包板,1 μg/ml,100 μl/孔,4 ℃包被16 h;封閉液(1% BSA、0.1% Tween-20)300 μl/孔,4 ℃封閉16 h,PBS-T洗板3次;血清稀釋后加樣,37 ℃孵育1 h,PBS-T洗板3次;加1∶1 000稀釋的羊抗鼠HRP-IgG,37 ℃孵育30 min,PBS-T洗板5次;加ELISA底物A、B液,避光37 ℃顯色10 min,2 mol/L硫酸50 μl/孔終止反應(yīng);450 nm波長下測定A值。

1.2.2.3細(xì)胞融合挑選2組中免疫效果最佳小鼠,分別取出脾臟,用高溫滅菌的銅網(wǎng)研磨,收取細(xì)胞,與NS-1細(xì)胞按5∶1混合。離心,棄上清液,于37 ℃水浴中緩慢加入1 ml PEG1450,1 min內(nèi)加完,分別于1、2、3、4、5 min內(nèi)加1、2、3、4、5 ml無血清RPMI-1640終止融合;最后加入10 ml含15% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,室溫300g離心5 min;棄上清液,用20 ml上述培養(yǎng)基重懸,平均分配至加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中,100 μl/孔,37 ℃培養(yǎng)。9 h后,加2.5×HAT、含15% FBS的RPMI-1640,100 μl/孔,進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。48 h后,更換為1×HAT,100 μl/孔。

1.2.2.4陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化LipL32重組蛋白、鉤體56601株全菌超聲裂解上清液作為包被抗原,用間接ELISA檢測96孔板中克隆細(xì)胞分泌上清液。挑選結(jié)果為陽性的繼續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增,以有限稀釋法亞克隆化篩選,共進(jìn)行2次篩選,篩選方法不變。將篩選出的單克隆抗體細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng),用含有空載Pet28b質(zhì)粒的(E.coli)BL21菌株超聲裂解上清液作為包被抗原,用間接ELISA對雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行復(fù)測,篩選出陰性的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.2.5腹水的制備與抗體的純化取10～12周齡BALB/c雌性小鼠6只,接種細(xì)胞前1周,腹腔注射降植烷0.5 ml;收集篩選出的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞,按每只小鼠給予6×105個細(xì)胞腹腔注射接種;待小鼠腹部脹大后(接種1～2周),引流腹水,可收集多次。采集的腹水采用辛酸/硫酸銨分步沉淀法提純。提純抗體經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)測定純度。

1.2.3 單克隆抗體生物學(xué)特性的鑒定

1.2.3.1亞類包被LipL32重組蛋白于96孔板中,1 μg/ml,100 μl/孔,包被、封閉。加入單克隆抗體細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清液,100 μl/孔。一抗為羊血清稀釋的羊抗鼠IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(按1∶1 000稀釋)。ELISA操作步驟同上。

1.2.3.2標(biāo)記抗體效價采用間接ELISA測定標(biāo)記生物素的單克隆抗體效價,BSA包被板條作陰性對照。LipL32重組蛋白包被濃度均為1 μg/ml,HRP-親和素稀釋度為1∶1 000,其他操作步驟同上?？贵w測定A值/陰性對照A值≥2.1時,抗體最低濃度即為抗體效價。

1.2.4 單克隆抗體的配對

1.2.4.1單克隆抗體標(biāo)記生物素4.4 mg/ml的生物素溶液30 μl與2 mg單克隆抗體在PBS中作用2 h,再以PBS充分透析,除去游離生物素,將標(biāo)記好的抗體凍存。

1.2.4.2單克隆抗體之間競爭抑制實驗檢測表位以重組LipL32蛋白1 μg/ml包板封閉,每孔先加入1 mg/ml純化的單克隆抗體50 μl,再分別加入生物素標(biāo)記的單克隆抗體50 μl,37 ℃孵育1 h,PBS-T洗滌3次;加入HRP-親和素,37 ℃孵育30 min,PBS-T洗滌5次;加入TMB顯色液,37 ℃避光顯色15 min,450 nm波長下測定A值。以單克隆抗體對同一生物素標(biāo)記單克隆抗體的抑制為陽性對照,以已知無關(guān)單克隆抗體對標(biāo)記單克隆抗體的抑制為陰性對照,計算各單克隆抗體間的抑制率。抑制率計算公式:(1-各孔測定值/陰性對照值)×100。抑制率>75%為相關(guān),50%≤抑制率≤75%為不完全相關(guān),25%≤抑制率<50%為不相關(guān),抑制率<25%為完全不相關(guān)。

1.2.4.3配對實驗包被抗體10 μg/ml,封閉后檢測。采用雙抗夾心ELISA兩步法進(jìn)行29株抗體的相互配對實驗,檢測LipL32蛋白設(shè)50、25、12.5、6.25、3.125 ng/μl共5個稀釋度,檢測鉤體56601株全菌超聲裂解上清液設(shè)500、250、125、62.5、31.25 ng/μl共5個稀釋度,無關(guān)蛋白為陰性對照,稀釋液為空白。所有樣品檢測加樣均為100 μl/孔。選擇檢測結(jié)果中A值均較高、空白與陰性對照值低的抗體對15株中國流行的及1株非致病性的鉤體再次檢測。選擇對該流行的15株A值高而對非致病株A值低的抗體保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.4特異性鑒定選取SARS病毒、登革病毒、金黃色葡萄球菌、曲霉的全菌超聲裂解上清液作為包被抗原,用間接ELISA檢測29株單克隆抗體的特異性。ELISA操作步驟同上。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE和蛋白免疫印跡法鑒定29株單克隆抗體

29株單克隆抗體細(xì)胞株是以腹腔接種小鼠制備的腹水型單克隆抗體,用辛酸/硫酸銨分布沉淀法純化,純化后單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE分析,抗體熱變性后分解為2條相同的重鏈(50×103處)和2條相同的輕鏈(25×103處),IgM的重鏈相對分子質(zhì)量(Mr)偏大些。SDS-PAGE分析顯示,所得單克隆抗體純度除22號外均較高(圖1)。

M, protein molecular marker; 1-29, mAbs against LipL32.

圖129株LipL32單克隆抗體SDS-PAGE分析

Fig.1SDS-PAGEanalysisof29monoclonalantibodiesagainstLipL32

蛋白免疫印跡法檢測29株單克隆抗體,結(jié)果如圖2所示,29株單克隆抗體在30×103處有一明顯條帶,表明29株單克隆抗體均與LipL32重組蛋白發(fā)生反應(yīng),且大部分條帶單一、特異性好。陰性對照為單克隆抗體稀釋液。

圖2蛋白免疫印跡法檢測29株LipL32單克隆抗體與鉤體抗原的特異性結(jié)合

Fig.2Specificreactivityof29monoclonalantibodiesagainstLipL32withLeptospiraantigenbyWesternblotanalysis

2.2 單克隆抗體的生物學(xué)特性

29株生物素標(biāo)記的單克隆抗體經(jīng)間接ELISA檢測,效價均在200 000以上,都可用來進(jìn)行配對實驗。其中單克隆抗體1、2、7、10、12、18為IgG2b類,3、4、5、6、9、11、13、14、15、16、19、20、21、26、27為IgG1類,8、23、25、29為IgG2a類,24、28為IgM類,22為IgG3類,17為其他亞類。

2.3 競爭抑制實驗結(jié)果

根據(jù)公式計算出各單克隆抗體間的抑制率,從而可看出各單克隆抗體間的抗原表位是否相同或存在交叉。結(jié)果這29株單克隆抗體的識別表位可分為8個組。第1組:1、7、8、12、17、25;第2組:2、9、10、20;第3組:3、14、23、27、29;第4組:4、5、6、11、13、18、26;第5組:19、21、22;第6組:24、28;第7組:15;第8組:16。這8個組代表8個不同的抗原識別表位。

2.4 配對實驗結(jié)果

用LipL32重組蛋白和鉤體56601株全菌超聲裂解上清液作為檢測抗原進(jìn)行配對實驗,挑選16對檢測效果較好的單克隆抗體為候選做進(jìn)一步篩選。這些單克隆抗體分別為2/b-17、2/b-26、4/b-10、6/b-10、7/b-2、7/b-10、9/b-7、9/b-26、12/b-2、12/b-10、19/b-7、19/b-10、19/b-12、20/b-7、20/b-12和27/b-10。再用15株中國鉤體流行株和1株非致病性鉤體作為檢測抗原,再次篩選候選單克隆抗體。結(jié)果19/b-12可檢測出15株中國鉤體流行株,并與1株非致病性鉤體無交叉反應(yīng);檢測LipL32重組蛋白靈敏度達(dá)1 ng/ml,與SARS病毒、登革病毒、金黃色葡萄球菌和曲霉的菌體抗原無交叉反應(yīng),靈敏度與特異度均非常理想。

3 討論

LipL32是鉤體外膜中含量最豐富的蛋白,且在致病性鉤體中高度保守,在鉤體病的診斷、疫苗研制及致病機(jī)制等方面發(fā)揮重要作用。MIF Bioinformatics網(wǎng)站生物信息學(xué)分析結(jié)果表明LipL32有8個抗原表位,本實驗制備的29株單克隆抗體能識別8個不同的抗原表位,已較全面地包含LipL32的抗原表位,且這些單克隆抗體的效價在200 000以上,這既為篩選合適的單克隆抗體提供了很好的候選資源,也為鉤體病的其他研究打下了基礎(chǔ)。國際上也有LipL32單克隆抗體的文獻(xiàn)報道,這些單克隆抗體被應(yīng)用于診斷和保護(hù)性實驗,并取得了一定的效果[6]。而且本實驗中29株單克隆抗體識別的抗原位點有8個之多,且成功配對篩選出很好的抗原檢測單克隆抗體,有著很好的應(yīng)用前景。

本實驗獲得了單克隆抗體19/b-12,檢測LipL32重組蛋白的靈敏度為1 ng/ml,可與國內(nèi)流行的15株致病性鉤體相關(guān)抗原發(fā)生特異性反應(yīng),而與非致病性鉤體菌體抗原無反應(yīng)。此外,它與SARS病毒、登革病毒、金黃色葡萄球菌的菌體抗原無交叉反應(yīng)。因此,該抗體可能在鉤體抗原的診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。

本實驗表達(dá)的LipL32重組蛋白在非變性條件下純化,保證了其免疫原性。由于表達(dá)載體是E.coli,為了保證篩選到特異性針對LipL32蛋白天然表位的單克隆抗體,一組小鼠全程用LipL32重組蛋白免疫,另一組小鼠用LipL32重組蛋白與鉤體外膜蛋白交替免疫,融合時選擇了2組中效價最高的各1只小鼠進(jìn)行實驗。最后篩選到的29株單克隆抗體分別來自這2只小鼠,從抗體數(shù)量和抗原識別表位分析,此2組小鼠差異無顯著性,從而證實,非變性條件下純化的LipL32重組蛋白也同樣具有很好的免疫原性。

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