陶曉宇，曾 瑜，段 答，劉 波，趙振宇，滕曉華，盧 明★

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410006；2.湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長沙410003）

臍血又稱胎盤血或臍帶血，是胎兒出生時臍帶和胎盤近胎兒側(cè)血管內(nèi)的血液。2000年Erice[1]報道臍血中含有大量間充質(zhì)干細胞祖細胞 (mesenchymalstem cell/mesenchymalprogenitorcell, MSC/MPC)。臍血MSC/MPC與骨髓MSC類似，具有多向分化潛能，可在一定條件下分化為骨細胞、軟細胞、肌肉細胞和神經(jīng)細胞的前體細胞。同時，臍血MSCs具有以下優(yōu)點：①來源豐富，易于獲取；②采集方便，對供者無痛苦；③免疫系統(tǒng)處于原始階段，移植后免疫排斥反應(yīng)??；④避免社會倫理和法律問題；⑤具有更強的增殖、分化能力。因此臍血MSC可能成為細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種很好的細胞來源，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。本試驗利用嗅鞘細胞上清液誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細胞,觀察其向神經(jīng)細胞分化的情況，為臍血間充質(zhì)干細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

新生SD大鼠(出生第5天)10只(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物部)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清FBS(Hyclone)，胰蛋白酶和膠原蛋白酶(Gibco)，L-多聚賴氨酸(Sigma)，阿糖胞苷(Ara-c)(Sigma)，兔抗人NSE(Sigma)，鼠單克隆抗體GFAP、小鼠二步法檢測試劑盒 (中彬金橋生物工程有限公司)，D-Hank's液和0.01 mol/L PBS均為本實驗室配制，離心管和50 mL玻璃培養(yǎng)瓶，解剖顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 臍血間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)

臍血取自湖南省婦幼保健醫(yī)院足月剖宮產(chǎn)的臍帶血，均經(jīng)父母授權(quán)同意。無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血約60 mL，肝素(20 U/mL)抗凝，加等體積無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋、輕輕搖勻。采用密度梯度離心法分離臍血單個核細胞(mononuclear cells,MNCs)：按3:2的比率加入有淋巴細胞分離液的試管中，2500 r/min水平離心25 min(離心半徑為16 cm)。試管內(nèi)液體分為四層，吸取中間的白膜層。加入3～5倍體積的PBS緩沖液稀釋，1000r/min離心洗滌10 min后棄上清液，再以同樣方法離心洗滌一次。臺盼藍染色、光學(xué)顯微鏡下計數(shù)活細胞，用MesenCult培養(yǎng)液調(diào)整至1.0× 106/mL的細胞密度用于細胞培養(yǎng)。置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，24h后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞，根據(jù)細胞生長情況，每3～5天半量換液一次。待細胞達到80%時，用0.125%的胰酶消化，然后按1:3的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每3天半量換液一次，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復(fù)上述操作，傳代培養(yǎng)記為P2代，其余類推，傳代到P3代。

1.3 大鼠嗅鞘細胞的培養(yǎng)

選用新生1～2天的SD大鼠10只，放入絡(luò)合碘中浸泡消毒15min，在超凈臺內(nèi)顯露兩側(cè)嗅球，并將之完整取下，置于盛有PBS平衡鹽溶液的4℃冰浴的培養(yǎng)皿中,在解剖顯微鏡下仔細去除嗅球表面的毛細血管和軟腦膜，取下纖維層和嗅小球?qū)?，用眼科剪剪碎?.25%的胰蛋白酶 37℃消化 15 min，DMEM(含10%胎牛血清)終止消化，巴氏吸管吹打后用80μm的細胞篩過濾，離心濾液 (1000 r/ min，10 min)，棄上清，DMEM(含10%胎牛血清)重懸細胞，將細胞以5×104/mL接種于無包被的玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1h后輕輕振蕩培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細胞懸液重新種植到令一無包被的玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，8h后再將未貼壁的細胞懸液接種到用另一個用多聚賴氨酸包被的玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，24 h后加入終濃度為2 mg/L的AraC，24 h后全量換液，并用PBS洗一遍，除去AraC的作用，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天半量換液一次。當(dāng)細胞數(shù)量達到大約80%時吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無血清DMEM)。孵育24 h后收集條件培養(yǎng)液。-20℃保存條件培養(yǎng)液。

1.4 誘導(dǎo)分化

分為實驗組和對照組。實驗組：取P3代MSCs按6×1/mL接種到事先放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片六空板內(nèi)，24 h后用OECs無血清上清液培養(yǎng)，2天半量換液一次。對照組：用OECs培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.5 免疫組化鑒定

采用 SABC改良法進行免疫細胞化學(xué)檢測，取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，0.01 mol/L PBS沖洗，加一抗4℃過夜，生物素化二抗室溫孵20 min，鏈酶親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物室溫孵育 10 min，DAB顯色 3～5min，陰性對照不加一抗，光鏡下棕色細胞為陽性。

2 結(jié)果

2.1 臍血間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

3～4h部分細胞貼壁，24h后大量細胞貼壁，散在分布，呈圓形，3～4d后開始逐漸伸出突起,折光性好,逐漸在局部形成集落生長,以梭形細胞為主，胞漿豐富，核大，細胞平行或呈漩渦狀盤旋排列；7～9d以后MSCs迅速擴增,約2～3周后可達80%～90%融合,擴增變緩,即可傳代，并依次傳至第三代P3(如圖1)。

2.2 嗅鞘細胞的培養(yǎng)、觀察和免疫組化鑒定

體外培養(yǎng)，OECs呈橢圓形、梭形、三角形，折光性強，突起細長(圖2A)，培養(yǎng)第9天p75染色見大量陽性細胞(圖2B)。

2.3 細胞形態(tài)

實驗組培養(yǎng)24h后細細胞體收縮，形成圓形、錐形、三角形，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長，胞質(zhì)逐漸回縮，呈典型的核周形態(tài)，逐漸長出突起，并逐漸變細變長，有的末端發(fā)出分支，類似樹突、軸突，突起與突起之間連接成網(wǎng)，類似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞樣的形態(tài)(圖3,4)。誘導(dǎo)后14天用神經(jīng)元標(biāo)志物NSE和膠質(zhì)細胞標(biāo)志物GFAP鑒定，絕大部分細胞呈染色陽性(圖5,6)。

對照組培養(yǎng)后呈多形態(tài)(圖7)：有破骨樣細胞，胞體較大,多個核,圓形,有成纖維樣的長梭形細胞,單個核,有較長的突起,折光性強。培養(yǎng)7天后，NSE和GFAP鑒定無陽性細胞。

3 討論

用于移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的干細胞來源有胚胎腦組織、骨髓、臍血以及脂肪組織，其中MSCs被認為是良好的干細胞來源。自Sanchez和Buzanska等[2，3]報道了臍血MSCs體外可被誘導(dǎo)表達神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物，近來，用臍血間充質(zhì)干細胞作為神經(jīng)元來源替代凋亡或受損的神經(jīng)細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為研究的熱點[4,5]。一些動物實驗研究表明人臍血間充質(zhì)干細胞能改善中風(fēng)、脊髓損傷、阿爾茨海默病和尼曼病的神經(jīng)功能以及替代神經(jīng)干細胞來修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[6-9]。Ende等[10]證實人臍MSCs移植可明顯改善老年癡呆和亨廷頓氏病的癥狀。目前，多項實驗研究發(fā)現(xiàn)生長因子、抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、香丹注射液等都有誘導(dǎo)臍血MSCs向神經(jīng)細胞分化的作用[11-14]，但目前還沒有一種十分高效、可行的誘導(dǎo)方法。而且，有報道解釋說那些化學(xué)試劑誘導(dǎo)表型改變的一個合理解釋是一種細胞毒性而不是一種分化[15]。因此，目前如何能在體外培養(yǎng)、擴增臍血間充質(zhì)干細胞并誘導(dǎo)分化成更多的受限制的神經(jīng)細胞類型以便在結(jié)構(gòu)和功能上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損區(qū)整合成為研究的重點。

OECs是一種特殊類型的膠質(zhì)細胞，多項研究[16,17]發(fā)現(xiàn)鑒定了OECs分泌蛋白組中大量與神經(jīng)生長和再生相關(guān)的蛋白，如神經(jīng)生長因子（NGF）,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF),膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)素3、4(NT3、NT4),膠質(zhì)細胞生長因子2(GGF2)和層粘連蛋白(Laminin)等。Wen等[18]利用嗅鞘細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)其分化成神經(jīng)樣細胞，通過nestin、NSE、MAP2、GFAP和P75免疫組化和RT-PCR鑒定鑒定了分化后的神經(jīng)樣細胞，結(jié)果證實了骨髓間充質(zhì)細胞與嗅鞘細胞培養(yǎng)，能有效向神經(jīng)細胞分化。本試驗在此基礎(chǔ)上，利用嗅鞘細胞上清液對臍血間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)，獲得較高神經(jīng)元樣細胞的分化比例，通過對NSE、GFAP等分子標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細胞不僅神經(jīng)樣細胞樣形態(tài)，同時具備和表達及神經(jīng)細胞標(biāo)志物。Quirici等[19]認為MSCs的表面存在低親和力神經(jīng)生長因子受體(LNGFR)。生長因子受體都具有酪氨酸酶活性,當(dāng)生長因子與相應(yīng)受體結(jié)合后，經(jīng)過一系列的蛋白激酶激活，可以使許多蛋白底物磷酸化,最終引起早期的即刻基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，引起細胞增殖、分化等效應(yīng)。

本研究通過新生大鼠嗅鞘細胞無血清上清液誘導(dǎo)MSCs,通過對NSE、GFAP等分子標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)分析,證實了在體外培養(yǎng)條件下,新生大鼠嗅鞘細胞無血清上清液可定向誘導(dǎo)臍血源MSCs向神經(jīng)樣細胞方向分化。但誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細胞的具體分子結(jié)構(gòu)及電生理特性和誘導(dǎo)分化的具體機制有待進一步研究。

[1]Erices A,Conget P,Minguell JJ,et al.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood [J].Br J Haematol, 2000,109(1):235-242.

[2]Sanchez-Ramos JR,Song S,Kamath SG,et al.Expression of neural markers in human umbilical cord blood[J].Exp Neurol,2001,171(1):109-115.

[3]Buzańska L,Machaj EK,Zab?ocka B,et al.Human cord blood-derived cells attain neuronal and glial features in vitro [J].J Cell Sci,2002,115(Pt 10):2131-2138.

[4]Harris DT.Cord blood stem cells:a review of potential neurological applications[J].Stem Cell Rev,2008,4(4):269-274.

[5]Hirko AC,Dallasen R,Jomura S,et al.Modulation of inflammatory responses after global ischemia by transplanted umbilical cord matrix stem cells[J].Stem Cells,2008,26(11): 2893-28901.

[6]Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[7]Dasari VR,Spomar DG,Li L,et al.Umbilical cord blood stem cell mediated downregulation of fas improves functional recovery of rats after spinal cord injury [J].Neurochem Res, 2008,33(1):134-149.

[8]Lee HJ,Lee JK,Lee H,et al.Human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells improve neuropathology and cognitive impairment in an Alzheimer's disease mouse model through modulation of neuroinflammation[J].Neurobiol Aging,2010(Epub ahead of print).

[9]Lee H,Bae JS,Jin HK.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells improve neurological abnormalities of Niemann-Pick type C mouse by modulation of neuroinflammatory condition [J].J Vet Med Sci,2010,72(6): 709-717.

[10]Ende N,Chen R,Ende-Harris D.Human umbilical cord blood cells ameliorate Alzheimer's disease in transgenic mice[J].J Med,2001,32(3-4):241-247.

[11]Greco SJ,Zhou C,Ye JH,et al.An interdisciplinary approach and characterization of neuronaI cells transdifferentiated from human mesenchymal stem cells J].Stem Cells Dev, 2007,16(5):811-826.

[12]Mareschi K,Novara M,Rustichelli D,et a1.Neural differentiation of human mesenchymal stem cells：Evidence for expression of neuraI markers and eag K+channeI types[J].Exp Hematol,2006,34(11):1563-1572.

[13]黃偉,祝建中,苗宗寧,等.臍血源性間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞誘導(dǎo)分化的研究 [J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2007,11(6): 23-26,38.

[14]于麗,張炳強,管英俊等.香丹注射液誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞的分化 [J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(14):2656-2660.

[15]Lu P,Blesch A,Tuszynski MH.Induction of bone marrow stromal cells to neurons:differentiation,transdifferentiation, or artifact[J]J Neurosci Res,2004,77(2):174-191.

[16]Woodhall E,West AK,Chuah MI.Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor,brain-derived neurotrophic factor,glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,88(1-2):203-213.

[17]Liu Y,Teng X,Yang X,et al.Shotgun proteomics and network analysis between plasma membrane and extracellular matrix proteins from rat olfactory ensheathing cells[J].Cell Transplant,2010,19(2):133-146.

[18]Ni WF,Yin LH,Lu J,et al.In vitro neural differentiation of bone marrow stromal cells induced by cocultured olfactory ensheathing cells[J].Neurosci Lett,2010,475(2):99-103.

[19]Quirici N,Soligo D,Bossolasco P,et al.Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies[J].Exp Hematol,2002,30(7):783-791.