王 琰 朱新宇 王 霞 王 東

HCV是黃病毒科肝炎病毒屬RNA正鏈病毒，由于HCV基因組的變異性，存在不同基因型，我國(guó)幾種主要的基因型 1a、1b、2a、2b、3a均有報(bào)道[1]。HCV 感染后臨床表現(xiàn)程度輕重與所感染基因型有一定關(guān)系，1b型較非1b型肝功能損害明顯，易導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。研究表明，基因1b型是對(duì)干擾素治療無應(yīng)答的獨(dú)立性預(yù)測(cè)因子[2，3]。1a、2a、3 型對(duì)干擾素療效較好，1b 型幾乎沒有療效[4]。由于1b型患者對(duì)干擾素治療的敏感性較低，導(dǎo)致1b型病毒在體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)，因長(zhǎng)期感染而導(dǎo)致肝硬化和肝癌[5]。本試驗(yàn)選擇HCV保守的5’非編碼區(qū)（5’UTR區(qū)）作為擴(kuò)增片段，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（RFLP法）對(duì)本組患者進(jìn)行HCV基因型的檢測(cè)，了解本地區(qū)患者主要基因型，分析基因型與病情的關(guān)系。

材料與方法

一、研究對(duì)象 收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院感染病科和我院2005年7月～2006年8月住院的丙型肝炎患者62例，男性34例，女性28例，平均年齡49.9±12.2歲。診斷符合2000年9月西安第10次全國(guó)傳染病與寄生蟲病和肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)。其中慢性肝炎輕度14例，中度39例，重度5例，肝硬化4例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：血清抗-HCV陽(yáng)性、HCV RNA＞80copies/ml，伴或不伴肝功能異常。

二、引物的合成和試劑來源 自Genebank中查找HCV 1a、1b、2b、3a型全序列，查找各型 5’UTR 區(qū)共同序列，并以此自行設(shè)計(jì)引物。外引物：S1（nt34～54）：5’-ATCACTCCCCTGTGAGGAAC-3’；S2（nt279～299）：5’-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3’。內(nèi)引物：S3（nt39～59）：5’-TCCCCTGTGAGGAACTACTG-3’；S4 （nt274～294）：5’-TCAGGCAGTACCACAAGGCC-3’。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。主要試劑來源：Trizol購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Taq DNA聚合酶及dNTP購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；HaeⅢ購(gòu)自TBD生物工程有限責(zé)任公司；Bsh1236Ⅰ購(gòu)自華美生物工程有限公司。

三、HCV RNA提取、AMV反轉(zhuǎn)錄 所有入選病例及對(duì)照清晨空腹肘靜脈采血4ml，12000rpm離心10分鐘，取上清，統(tǒng)一置于-70℃冰箱保存待檢。采用Trizol法提取上述血清中病毒RNA：取血清30μl加入Trizol溶液、氯仿及異丙醇，經(jīng)乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌，提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。在 EP 管中依次加入模板 RNA、oligo（dT）16、dNTP mixture、RNase Inhibitor、AMV 及 DEPC 水，離心混勻，42℃保溫1小時(shí)，95℃保溫5分鐘后冰上冷卻，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。該反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。

四、巢式PCR擴(kuò)增和酶切反應(yīng) 在EP管中依次加入 cDNA 模板，Taq DNA 聚合酶，10×PCR buffer，上游引物（25mM），下游引物 1μl，dNTP，滅菌去離子水，置PTC-100型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，經(jīng)95℃預(yù)變性4min，95℃變性 30sec，55℃退火 30sec，70℃延伸 30 sec，70℃延伸5min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后得到第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物。以第一輪反應(yīng)產(chǎn)物為模板，相同條件下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物鑒定：取第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察結(jié)果。待在256bp左右出現(xiàn)明顯的DNA條帶，再進(jìn)行下一步的酶切反應(yīng)。取第二輪PCR產(chǎn)物，分別加入19.5μl HaeⅢ和Bsh 1236Ⅰ及buffer溶液，在37℃水浴中孵育2h后，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05有顯著性差異。

結(jié) 果

一、HCV基因型分布 結(jié)果顯示：第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物為 256bp條帶；1a及 1b型由 HaeⅢ酶切得到243bp、18bp兩條片斷，1a型由Bsh 1236Ⅰ酶切得到231bp和25bp兩條片斷，1b型由1236Ⅰ酶切得到201bp、30bp和 25bp三條片斷（圖 1）；2a型由 HaeⅢ酶切得到 78bp、106bp、56bp和 18bp四條片斷，無1236Ⅰ酶切位點(diǎn)（圖2）；3a型由HaeⅢ酶切得到80bp、158bp和18bp三條片斷，由1236Ⅰ酶切得到28bp、203bp和25bp三條片斷（圖 3）；1b/2a混合型如圖4。分析結(jié)果表明62例丙型肝炎患者中，HCV基因型以1b型為主，占69.4%（43/62），2a型14.5%（9/62），1b/2a型 8.1%（5/62），1a型、3a型各 1例，分別占1.6%，未分型者3例，占4.8%，無2b型，未見有其他型分布。

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

二、基因型與患者病情關(guān)系 以1b型和其他型病例中不同病情病例所占比例為依據(jù)進(jìn)行“x2檢驗(yàn)”，探討基因型與病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。x2檢驗(yàn)表明，1b型與其他型病情構(gòu)成存在差別（x2=12.54，P＜0.005）。結(jié)合本資料分析表明：1b型感染所致疾病病情較其他型更為嚴(yán)重。

表1 不同基因型中患者病情的比較

討 論

HCV基因組變異明顯，平均每個(gè)位點(diǎn)核苷酸變異頻率約10-3/年[1]，因此HCV存在不同基因型。自1989年Choo獲得首株HCV的基因克隆，并完成了核酸序列測(cè)定以來，目前已有許多關(guān)于HCV全序列及部分序列的報(bào)道。目前，根據(jù)Simmonds分型系統(tǒng)全世界范圍內(nèi)已克隆到的分離株可分為6個(gè)基因型，68個(gè)亞型[6]。本實(shí)驗(yàn)采用了對(duì)較為保守的5’UTR區(qū)進(jìn)行RFLP法分型，該區(qū)對(duì)1a～6a不同基因型的cDNA均能獲得良好的擴(kuò)增效果[7]。不同地區(qū)HCV基因分布有所差異，歐美國(guó)家以1a為主，亞洲包括我國(guó)以1b型為主，我國(guó)幾種主要的基因型 1a、1b、2a、2b、3a均有報(bào)道[1]。本試驗(yàn)所得結(jié)果與國(guó)內(nèi)報(bào)道相近[8]。本次試驗(yàn)檢測(cè)HCV基因型結(jié)果顯示1b型占優(yōu)勢(shì)，2a型次之，其次是1b/2a混合型，并檢出1a和3a型各一例。該結(jié)果與吳立平[9]等人的研究結(jié)果相似。另有3例未檢出者，可能是本實(shí)驗(yàn)未涉及到的其它基因型，也可能是由于RNA污染或其他技術(shù)上的問題，有待進(jìn)一步完善。

1b型有較高的復(fù)制能力和血清反應(yīng)性，較強(qiáng)的肝細(xì)胞損害作用及較低的IFN治療反應(yīng)性等[1]。本實(shí)驗(yàn)中，1b型患者中度及重度和肝硬化中比例較高，分別占到84.6%和55.6%，而9例2a型患者輕度7例，中度1例，重度1例，主要為輕中度患者，5例1b/2a混合型患者2例為中度，3例為重度及肝硬化，另有1a型1例為輕度，3a型1例為輕度。中重度患者多為1b型，該型患者病情較重，且較易發(fā)展為肝硬化。該結(jié)果與Delice D等研究結(jié)果相同，HCV基因型與特定的組織病理學(xué)程度、肝臟炎癥程度相關(guān)[10]。

我們的研究結(jié)果與其他地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果相似，這對(duì)當(dāng)?shù)乇透窝谆颊叩闹委熀皖A(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)意義。本研究的不足之處在于：樣本例數(shù)較小，研究對(duì)象以慢性肝病為主，缺乏無癥狀患者及重型肝病患者，有必要擴(kuò)大樣本量，選擇人群資料進(jìn)一步研究。HCV基因型可以預(yù)測(cè)IFN對(duì)HCV的抗病毒治療效果[11～12]。HCV基因型也可指導(dǎo)患者干擾素治療所需的療程[13～14]。因此，治療前檢測(cè)HCV基因型有重要的臨床意義。

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